Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека

• Автор: Солодарь, Леонид Ильич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Надсемсйство цитохромов Р

1.1.1 Бактериальные водорастворимые Р0содержащие системы

1.1.2 Микросомальные Р0зависимые монооксигеназные системы

1.1.3 Митохондриальные Р0зависимые монооксигеназные системы

1.1.4 Каталитический цикл микросомальных Р0

1.1.5 Основные типы реакций, катализируемые цитохромами Р0

1.1.6 Цитохромы Р0 человека и их значение

1.1.7 Цитохромы Р0 1А2 и 2В4
1.2 Экспрессия эукариотических цитохромов Р0 в ii i
1.2.1 Общие принципы создания экспрессионных систем Р0
1.2.2 Водорастворимые формы Р0
1.2.3 Оптимизация экспрессии
1.2.4 Очистка рекомбинантных цитохромов Р0
1.3 Пространственная структура Р0
1.3.1 Консервативные структурные последовательности Р0
1.3.2 Роль концевого региона и пролинбогатого участка
эукариотических Р0
1.3.3 Г ипервариабсльные участки Р0 модель Г ото
1.3.4 Роль заряженных аминокислотных остатков молекулы Р0 в межмолекулярных взаимодействиях с компонентами монооксигеназных систем эукариот
Заключение по обзору литературы
2. Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы и приборы
2.1.2 Ферменты нуклеинового обмена
2.1.3 Бактериальные штаммы и ДНК
2.1.4 Среды и антибиотики
2.1.5 Олигонуклеотиды, использованные в работе
2.2 Методы
2.2.1 Компьютерное моделирование модифицированных форм 1А
2.2.2 Методики клонирования и микробиологические методы
2.2.3 Методики химии белков
2.2.4 Аналитические и биофизические методы исследований
3. Результаты и обсуждение
3.1 Создание экспрессионных систем
3.1.1 Выбор участка для введения сайта протеолиза в молекулу 1А
3.1.2 Кассеты экспрессии
3.1.3 Оптимизирование условий культивирования штаммов Е. iпродуцентов рекомбинантных цитохромов
3.1.4 Оптимизация условий экспрессии рекомбинантных Р0 2В4 в ферментере
3.1.5 Анализ экспрессии рекомбинантных цитохромов 2В4 и 1А2 методом иммуноблоттинга 8
3.2 Выделение и очистка вариантов рекомбинантных 0 2В4 и 1А2
3.2.1 Очистка 242 и 242i6 с помощью глутагионСефарозы ,
3.2.2 Очистка 0 с концевыми полигистидиновыми модификациями
3.2.3 Разностные спектры поглощения некоторых очищенных рекомбинантных цитохромов Р0
3.3 Ферментативные характеристики модифицированных форм 0 2В4 и
3.3.1 Энзиматические свойства вариантов 0 2В4
3.3.2 Энзиматические свойства 0 1А2
Заключение
Выводы
Благодарности
Список литературы


Цитохромы Р0 0, Р0 суперссмейство гемсодержащих белков типа, образующих в восстановленном состоянии комплекс с окисью углерода, дающий полосу максимального оптического поглощения при длине волны 0 нм. Эти белки обнаруживаются практически у всех представителей животного, растительного и бактериального царств и отсутствуют только у строго анаэробных бактерий Арчаков А. И., . . М. ., . Цитохромы Р0 относятся к классу монооксигеназ или оксидаз со смешанной функцией и катализируют, по меньшей мере, типов реакций, в том числе реакции ароматического и алифатического гидроксилирования, О, С и деалкилирования, дегалогенирования, образования эпоксидов и др. Метелица Д. И. и соавт. Окисление ряда веществ цитохромами Р0 также может приводить к образованию конечных или промежуточных продуктов реакции, обладающих токсическими, канцерогенными или аллергенными свойствами i . С. i . ., i . С. . v . I. v . I., ii . Функции цитохромов 0 не ограничены катаболизмом соединений экзо и эндогенной природы биосинтез стероидных гормонов, простагландинов и метаболитов арахидоновой кислоты также катализируется цитохромами Р0 . Цитохромы Р0 эукариот, а также другие основные компоненты Р0зависимых монооксигеназных ферментных систем являются мембраносвязанными белками и локализованы в мембранах эндоплазматического ретикулума и внутренней мембране митохондрий микросомальные и митохондриальные Р0, соответственно. Р0, крайне осложняет их выделение и исследование физикохимических свойств. Несмотря на интенсивные исследования Р0 в течение более чем ти лет, многие аспекты структурнофункциональных взаимоотношений Р0 млекопитающих остаются мало изученными. Методологией, с помощью которой удается получить индивидуальные формы Р0, является гетерологичная экспрессия кДНК Р0 в культуре клеток млекопитающих, насекомых, в клетках ii i и дрожжей vii i . . . . . . . . ., . Наглядным примером эффективности и возможностей этого подхода явилось получение данных ренгеноструктурного анализа для микросомалыюго эукариотического цитохрома Р0 2С5 v С. . ii . . . Клетки . Р0, поскольку в отличие от культур клеток млекопитающих и дрожжей, обеспечивают высокий уровень продукции целевого белка, являясь на сегодняшний день самыми изученными и простыми в обращении с точки зрения генетической инженерии микроорганизмами. Несмотря на большое число публикаций, посвященных экспрессии цитохромов Р0 в различных системах, к настоящему времени все еще не существует универсального подхода для их эффективного гетерологичного продуцирования. В связи с этим представлялось важным изучить особенности наработки рекомбинантных цитохромов Р0 1А2, 2В6 и 2В4 млекопитающих в клетках . Основной стратегией получения мономерных форм Р0 высших эукариот является экспрессия укороченных вариантов этих энзимов, лишенных гидрофобного концевого сигнального участка, служащего якорной частью цитохрома в мембране . . . . . . . концсвого района при ограниченном протеолизе в генетически введенном сайте . . Для белков эукариот с низким уровнем экспрессии в гетерологичных системах широко используются химерные конструкции с глутатионтрансферазой и полигистидиновыми последовательностями i . В. . Это не только позволяет повысить уровень экспрессии и растворимость целевого белка, но также проводить его очистку в одну стадию с использованием соответствующего аффинного хроматографического сорбента. Целью настоящей работы была разработка экспрессионных систем для Р0 1А2 и 2В4 с наиболее высоким уровнем выхода целевого белка оптимизация, упрощение и универсализация подходов к экспрессии и очистке цитохромов Р0. Получить штаммыпродуценты для эффективной экспрессии вариантов рекомбинантных белков семейства цитохромов Р0 в клетках Е.