Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы E. coli и ее мутантных форм

• Автор: Мельников, Эдвард Эдуардович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

Структура и функции зависимых протеи паз . i

обзор литературы

1. Серпневая проенназа

1.1. Эндогенные субстраты протеиназы

1.2. Ферментативная активность протеиназы i vi

1.3. Структура пептидгидролазного центра протеиназы

2. алло зависимая протеииаза

3. С1рпро геиназы

3.1. АТРазные компоненты С1рАХРпротсиназ
3.2. Пептидгидролазный компонент сернновых СрАХРпроеиназ
3.3. Треониновая V С1рУпротеиназа
4. Структурная гомология регуляторных компонентов
АТРзависимых протсиназ
Заключение
Результаты и обсуждение
1. Кинетические аспекты гидролиза АТР при функционировании i vi
I проснназм . i
1.1. АТРазная активность протеиназы в стандартных условиях
1.2. АТРазная активность проеииазь и содержание ионов 2
1.3. Ингибирование АТРазной активности фермента
аленози иди фосфатом
1.4. Функциональное значение эффекта активации гидролиза АТР в присутствии белкового субстрата
1.5. Существование в структуре протеиназы дополнительных центров связывания белкового субстрата
Стр.
2. Гидролиз и эффективность функционирования пептидгидролазных
петров I оппрокиназы
2.1. Эффекторное действие нуклеотидов
2.2. зависимые эффекты при функционировании пен шдгидролазных центров протеиназы
3. Мутагенез гена I .i К получение и характеристика
мутантных форм лротеиназы
3.1. Планирование и проведение мутагенеза
3.2. Выделение и стандартная характеристика мутантных белков i vi
3.3. Тестирование функциональной активности мутантных форм
протеиназы i viv
3.4. Особенности функционирования мутантных белков
4. Перспективные аспекты исследования Гоппротеиназы
4.1. Аллостерическая активации пептидгидролазных центров и функциональное сопряжение гидролиза АТР и протеолиза
4.2. Процессивность деградации белковых субстратов энергозависимость и процессивность
4.3. Процессивность и селективность энергозависимость и селективность
Заключение
Экспериментальная часть
1. Материалы
2. Методы
Выводы
Список литературы


Клонирование гена I и определение его структуры было осуществлено одновременно в лаборатории химии протеолитических ферментов Института биоорганическои. РАН . Л.. Регуляторная последовательность гена содержит 8 пл. Структурная часть этого гена кодирует белок, состоящий из 7X4 аминокислотных остатков . Уолкера Л и В, ответственные за продуктивную для гидролиза АТР координацию трифосфата нуклеотида и иона 12 в АТРазиом цен тре Сконцевого протсолитического домена Рдомсн, включающего каталитически активный остаток серина 9 рис. I Ыконцевой части 1домсн, вариабельной в подсемействе Ьоппротеиназ. Рис. Схема строения протеиназы ii Показаны границы предполагаемых доменов, локализация мотивов А и В Уолкера и фрагмента, включающего каталитический остаток серина. По первичной структуре протеиназа йе обнаруживает гомологии е другими известными протеиназами в том числе и сериновычп. Молекула фермента представляет собой гомоолигомер, образованный субъединицами е молекулярной массой ,4 кДа. Методом гельфильтрации в препаратах протеиназы были обнаружены тегра и октамерные формы . Физиологически активная форма иротеииазы, вероятно, представляет собой тетрамер , . Существуют наблюдения, свидетельствующие в пользу кооперативного функционирования активных центров фермента , . Интересное и малоизученное свойство фермента его способность связываться с ДНК . Следует отметить, что впервые протеиназа была выделена именно как ДНКсвязывающий белок , что, в свою очередь, позволило предположить ее участие в регуляции экспрессии генов. В работе показано, что одноцепочечная ДНК активирует протеолитическую и белокактивирусмую АТРазную активность фермента мРНК и тРНК не обладают таким действием . В работе установлено, что иротеиназа специфически связывается с богатыми участками нуклеотидной последовательности ДНК. Физиологическая роль связывания ДНК к настоящему времени не определена. Исследования, проведенные в работах , , позволили установить, что один из субстратов протеииазы , позитивный регулятор транскрипции генов, при экспрессии которых образуются ферменты, необходимые для синтеза капсулярных мукополисахаридов. Этот белок нестабилен в I клетках период нолужизни менее 5 мин, но относительно стабилен в I клетках период полужизни мин . При делении I клеток между делящимися клетками не происходит образования клеточных стенок, что приводна к формированию длинных нитевидных структур. Известно, что I мутанты особо чувствительны к воздействию УФизлучения . УФоблучение индуцирует экспрессию гена , продукт которого белок нарушает процесс клеточного деления и, в частности, образование межклеточных перегородок. Экспрессия не влияет на систему репарации ДНК . Быстрое расщепление время полужизни 12 мин протеиназой в клетках дикого тина обеспечивает переход к нормальному делению после повреждения ДНК. В I мутантах период полужизни белка возрастает до мин , что вызывает его накопление в клетках. Небольшой кДа белок , участвующий в процессах антитерминации транскрипции в период литичеекой стадии развития фага А, также является физиологическим субстратом протеииазы 5, . В работе 5 показано, что белок и гибридный белок подвергаются деградации протеиназой также i vi, причем гидролиз белка наблюдается в присутствии как АТР, так и его негидролизуемого аналога 5. Деградация в составе гибридного белка, содержащего мальтозосвязывающий белок белокноситель, происходит только при гидролизе АТР . Белок 9 кДа, белокантидот белка ингибитор ДНКгиразы, также является субстратом для протеиназы . Результаты исследований, приведенные в работах 5. протеиназа распознает свои физиологические субстраты , и без участия шаиеронов. Однако, в ряде случаев , при деградации белков протеиназой i viv участие молекулярных шаиеронов и обнаруживается. В работе показано, что шапероны необходимы при деградации белков, имеющих тенденцию к быстрой агрегации.