ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке

• Автор: Невзорова, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 170 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Системная красная волчанка.

1.2. Аутоантитела к ДНК.

1.2.1. Обнаружение аутоантител к ДНК

1.2.2. Биологическая роль аутоантител к ДНК

в норме и патогенезе СКВ

1.2.3. Получение препаратов аутоантитсл к ДНК.

1.2.4. Иммунохимичсскис свойства патологических

аутоантител к ДНК.

1.2.5. Структура патологических аутоантител к нДНК

1.2.6. Взаимодействие аутоантител с ДНК.
1.3. Каталитические антитела
1.3.1. Открытие новых функций антител.
1.3.2. Механизмы каталитического действия антител.
1.3.3. Причины возникновения природных аутоантител
с нуклеазной активностью
1.3.4. Биологическая роль природных абзимов.
1.3.5. Получение препаратов природных каталитических
антител с нуклеазной активностью
1.3.6. Нуклеазная активность природных каталитических антител.
1.4. Атомносиловая микроскопия.
1.5. Заключение по обзору литературы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Оборудование и реактивы
2.2. Объект исследования
2.3. Получение сыворотки крови и осаждение антител сыворотки сульфатом аммония
2.4. Обессоливание антител сыворотки крови
методом гельфильтрации на акрилексе Р6.
2.5. Фракционирование антител сыворотки крови методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе.
2.6. Подбор оптимального нДНКсорбента для аффинной
хроматографии антител
2.6.1. Ковалентная посадка нДНК эпоксиактивацией
на носители и заполнение колонок.
2.6.1.а. ДНКцеллюлоза
2.6.1.6. ДНКсефароза.
2.6.2. Нековалентная посадка нДНК на носители
и заполнение колонок.
2.6.2.а. ДНКцеллюлоза микрокристаллическая.
2.6.2.6. ДНКцеллюлоза волокнистая
2.6.3. Проведение аффинной хроматографии
на приготовленных нДНКсорбентах.
2.7. Получение антител к нДНК аффинной хроматографией
на нДНКцсллюлозе микрокристаллической.
2.8. Электрофоретический анализ антител
в полиакриламидном геле в присутствии ЭзИа
2.9. Изоэлсктрическое фокусирование.
2 Иммуноферментный анализ
. Исследование влияния активных форм кислорода
на взаимодействие антител с ДНК
. Статистическая обработка данных
. Подбор оптимального разведения коньюгага.
2 Выделение плазмидной ДНК рВЯ2.
. Рост бактерий и амплификация плазмиды
. Выделение и очистка плазмидной ДНК рВЯ2.
. Оценка результатов.
2 Гидролиз ДНК плазмиды рВЯ2 антителами к ДНК.
. Изучение зависимости ДНКгидролизующей активности антител от реакционной среды
. Оценка влияния ионов двухвалентных металлов на активность антител к ДНК.
. Подбор оптимальных концентраций активных форм кислорода и оценка их влияния на активность
антител к ДНК
. Гидролиз плазмидной ДНК рВЯ2 антителами к ДНК
. Определение кинетических параметров реакции
гидролиза плазмидной ДНК рВК2 антителами к ДНК
. Контроли.
2 Электрофоретический анализ плазмидной ДНК
рВК2 в агарозном геле
2 Флуоресцентная спектроскопия.
2 Атомносиловая микроскопия.
. Приготовление образцов.
. Визуализация ДНК и антител.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Выделение и характеристика антител к нативной ДНК
из сывороток крови больных СКВ.
3.1.1. Выделение из сывороток крови
содержащих антитела к ДНК
3.1.2. Фракционирование антител к нативной ДНК
методом аффинной хроматографии на ДНКсорбенте.
3.1.2а. Приготовление аффинных нДНКсорбентов.
3.1 Фракционирование антител к нДНК.
3.2. Исследование ДНКгидролизующей активности антител к ДНК
3.2.1. Изучение влияния состава инкубационной среды на ДНКгидролизующую активность антител к нДНК
3.2.2. Изучение влияния активных форм кислорода на активность антител к нДНК и ДНКаз сывороток крови больных СКВ.
3.2.3. Кинетические характеристики реакции гидролиза плазмидной ДНК рВ 2 антителами к нДНК.
3.2.4. Изучение гидролиза плазмидной ДНК рВ
антителами к нДНК
3.3. Визуализация взаимодействия и активности антител к нДНК
с ДНК методом атомносиловой микроскопии.
3.3.1. Подбор и оптимизация методики приготовления
образцов ДНК для АСМ.
3.3.2. Подбор и оптимизация параметров сканирования
молекул ДНК и обработка полученных изображений.
3.3.3. Исследование взаимодействия и активности
антител к нДНК с ДНК.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Заболевание связывают со снижением иммунной толерантности к собственным антигенам с продукцией множества аутоантител ААТ различной направленности, обозначаемых общим термином фактор V . Эти ЛАТ взаимодействуют с ДНК, РНК, нуклсопротеинами, гистонами, другими структурами ядерных, цитоплазматических компонентов клеток и поверхностными клеточными антигенами. Только в сыворотке больных СКВ общепринятыми методами обнаруживаются в значительных количествах ААТ к ДНК и ААТ к цитоплазматическому БтРНП, которые имеют диагностическое значение и представляют один из классификационных критериев для СКВ, предложенных американским колледжем ревматологии . Однако, если уровень антиБшААТ в течение болезни относительно постоянен, то титр ААТ к ДНК сильно изменяется v . СКВ характеризуется полиморфизмом клинической картины в зависимости от остроты болезни и локализации изменений. Возможны изменения со стороны любых органов и систем. Развивается воспаление, изменения соединительной ткани, генерализованное поражение сосудов. Часто возникает по
ражение кожи типичен эритематоз в виде бабочки на лице, но могут быть и разнообразные другие сыпи, обычно в сочетании с суставными проявлениями, лихорадкой. Возможны поражения лгких, сердца III, . Очень характерно поражение почек разной степени тяжести от очагового, обычно доброкачественного гломерулита, до диффузного мембранознопролиферативного гломсрулонефрита с протеинурией, что, наряду с поражением центральной нервной системы i , , является наиболее тяжлым поражением при СКВ , . Течение болезни острое, подострое или хроническое многолетнее с обострениями. Если удатся подавить активность болезни в самом начале, то отдалнный прогноз благоприятен ред. Беркоу, . Лечение СКВ зависит от локализации и тяжести патологического процесса. Основным методом лечения являются глюкокортикоиды, иммунодепрессанты, а также хинолиновые производные, антикоагулянты, интерфероны. Для лечения СКВ применяют пульстерапию, плазмаферез замена плазмы больного донорской и гемосорбцию. Большие возможности представляют применение антиидиотипических моноклональных АТ, способных активировать систему комплемента, подавлять синтез ААТ к ДНК, способствуя, таким образом, клинической ремиссии СКВ инъекции нуклеозидами, олигонуклеотидами, которые могут индуцировать иммунную толерантность ред. Беркоу, , i . Обнаружение аутоантител к ДИК В г. СКВ были впервые обнаружены ААТ к ДНК ii . Аутоантитела , которые взаимодействуют хотя бы с одним аутоантигеном антигеном собственных тканей как в норме, так и при патологии ix . В последующие годы было установлено наличие ААТ к ДНК у практически здоровых животных v . СКВ, не имеющих никаких клинических симптомов заболевания. В настоящее время, эти ЛАТ считаются постоянным компонентом иммунной системы и, так как они не связаны с аутоиммунной патологией и циркулируют в крови в отсутствие преднамеренной иммунизации антигеноммишенью, в литературе называются нормальными, или естественными, ААТ к ДНК. Также повышенный уровень ААТ к ДНК обнаружен у людей, принимающих хлорпромазин, прокаинамид, гидралазин, изониазид, титр которых падает по окончании прима препаратов Семнов, , в сыворотках крови практически здоровых рабочих, имевших контакт с бериллием, гербицидами группы мочевины и базудином Воробьва, , у людей, страдающих самыми разнообразными заболеваниями хронические инфекции, поражения лгких . Различия в уровне ААТ между группами здоровых и больных статистически достоверны. Однако высокий уровень содержания ААТ к нДНК в сыворотке крови является характерной особенностью именно СКВ. Авторы многих публикаций последних лет пришли к заключению, что повышение уровня ААТ к нДНК в сыворотках крови здоровых доноров является предвестником аутоиммунной патологии и коррелирует со степенью тяжести заболевания . СКВ. Например, и др. ИФА исследовали динамику повышения уровня ААТ к нДНК в сыворотках крови 0 пациентов с СКВ, поступавших с г. США, т. Было обнаружено, что у больных наблюдалось повышение уровня содержания ААТ к нДНК в течение одного года до развития СКВ. У пациентов диагноз СКВ был установлен в течение 9. ААТ к нДНК. В ряде случаев содержание ААТ увеличивалось после установления диагноза СКВ.