Система протеолитических ферментов полостного гетерофазного пищеварения и ее роль в деградации белковых антигенов

• Автор: Митин, Игорь Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 c. : ил

I. ВВЕДШИЕ
П. иБЗиР ЛИТЕРАТУШ
П. I. Расщепление белков под действием протеолити-ческих ферлентов в различных отделах желудочнокишечного тракта
П. 1.1. функционирование ферлентных систем, гидролизующих белки в начальных отделах желудочно-кишечного тракта
П. 1.2. Участие протеолитических ферлентов в гидролизе белков в тонком кишечнике
П. 1.3. Роль микрофлоры толстого кишечника в разложении компонентов пищеварительных секретов. . 23 П. 2. Структура пищеварительно-транспортных процессов в тонкой кишке
П. 2.1. Зона флокулярных гелеЕых структур
П. 2.2. Слой пристеночных слизистых наложений
П. 2.3. Зона мембранного пищеварения
П. 3. Протеолиз пищевых белковых антигенов в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных
и человека
П. 4. Заключение к литературному обзору
Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТиДы ИССЛДДиВАТШ
Ш. 1.1. Экспериментальные животные
Ш. 1.2. Получение флокулярных гелевых структур
Ш. 1.3. ипределение рН-зависимости активности трипсина и химотрипсина в дуоденальном содержимом и его растворенных шлокулярных гелевых структурах
Ш. 1.4. Получение препарата пристеночных
слизистых наложений
Ш. 2. Методы определения активности ферментоЕ. .. 48 Ш. 1.1. определение активности трипсина
Ш. 2.2. определение активности химотрипсина
Ш. 2.3. определение активности лейцинаминопептидазы
Ш. 2.4. определение активности катепсина Р
Ш. 2.5. определение активности катепсина В
Ш. 3. Исследование распределения трипсина е системах Ы VI {го , моделирующих гетерофазное полостное пищеварение
Ш. 3.1. Получение пищевого субстрата (денатурированный яичный белок)
Ш. 3.2. определение сорбции трипсина на пищевом субстрате (яичный белок; при разных pH
Ш. 3.3. Исследование распределения трипсина в системе: флокулярные гелевые структуры
жидкая фаза
Ш. 3.4. Исследование распределения трипсина в системе: агломерат пищевого субстрата с флоку-лярными гелевыми структурами-жидная фаза
III. 3.5.Определение десорбции трипсина из фло-кул геля и структур агломерата: флокулы геляпищевой субстрат
Ш. 3.6. Определение десорбции трипсина с поверхности пищевого субстрата
Ш. 3.7. Исследование перераспределения трипсина между агломератом: флокулярные гелеЕые струнтуры-пищевой белок и жидкой фракцией при
смене pH среды
Ш. 4. Иммунохимические методы исследования
Ш. 4.1. Получение иммуносорбентов
Ш. 4.2. Получение гипериммунной сыворотки к бычьему сывороточному альбумину ч БСА)
Ш. 4.3. Выделение моноспецифических к бычьему сыеороточному альбумину антител
Ш. 5. Получение бычьего сывороточного альбумина, ме-Т25
ченного изотопом I
Ш. 6. Количественное определение степени расщепления бычьего сывороточного альбумина при воздействии на него ферментов полостного гетерофазного пищеварения
в опытах /ап {го
Ш. 7. Статистическая обработка полученных результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ
1У. I. Сравнительная характеристика флокулярных гелевых структур и жидкой фракции содержимого двенадцатиперстной кишки, езятого натощак, в зависимости от
pH закисления
1У. 2.Влияние замораживания на ферментативную активность трипсина и химотрипсина в образцах дуоденального содержимого, взятого натощак
ГУ. 3. Влияние лиофильного высушивания на активность трипсина и химотрипсина в образцах дуоденального содержимого и его флокулярных структурах
17. 4. рН-зависимость активности трипсина и химотрипсина е дуоденальном содержимом и его растворенных

Ш. 2.4. Определение активности катепсина DДля определения активности катепсина D использовали модификацию метода Barrett; Heath , предложенную Васильевым и соавт. ( 15 ). Активность фермента определяли спектрофотометрически - на приборе " Hitachi MPF- 2 А" при «Явозб = 486 нм
и Л погл. = 388 ш*
Использованный в качестве субстрата препарат гемоглобина
крупного рогатого скота, производства Олайнского завода хим-реактжвов, подвергался предварительной очистке от низкомолеку-лярных примесей путем гель-фильтрации на сефадексе б-- 25 и лиофильно высушивался на сублимационной установке D2- 9с v ЧССР). В процессе определения в микропробирку вносили 40 мкл I М формиатного буфера ( pH 3,0), 40 мкл 6% раствора гемоглобина, 20 мкл 0,45$ раствора тритон-1-100 и 80 мкл исследрюго препарата. Пробы инкубировались в течение 30 мин. при 37°С, добавляли 180 мкл раствора ТХУ для остановки реакции и центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. Затем к 100 мкл супернатанта добавляли 2 мл и 50 мкл раствора флюорескамина.
С целью подавления активности пепсина, которой также способен вызывать гидролиз гемоглобина в указанных условиях определения, в ряде определений защелачивали анализируемые образцы 0,5 М трисбуферным раствором до pH 8,5 с последующей инкубацией в течение 2 часов при 4°С. Такая предварительная двухчасовая инкубация, выполненная для препарата пепсина (илайнский завод химреактивов), снижала пепсиновую активность в 30 раз.
Ферментативную активность выражали в микромолях тирозина, высвободившегося в результате расщепления гемоглобина в I мин. 1г. ( I мл) исследуемого образца.