Деградация метилфосфоната E.COLI: физиологические и биохимические аспекты

• Автор: Матыс, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список принятых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ФОСФОНАТЫ И ИХ ДЕГРАДАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМАМИ

1.1. Фосфонаты фосфорорганические соединения с СР связью

1.1.1. Природные и синтетические фосфонаты.

1.1.2. Микроорганизмы деструкторы фосфонатов.

1.1.3. Ферменты, разлагающие фосфонаты с активированной СР связью

1.2. Алкилфосфонаты с прямой неактивированной СР связью.

1.2.1. СР лиаза, разлагающая СР связь алкилфосфонатов

1.2.2. Микроорганизмы деструкторы алкилфосфонатов
1.3. Физиологическая и генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов
1.3.1. Физиологическая регляция разложения алкилфосфонатов
1.3.2. Генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов со стороны РЬо регул она.
1.3.3. Гены, кодирующие разложение алкилфосфонатов.
Заключение.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Условия культивирования.
2.3. Методы работы с ДНК.
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК
2.3.2. Получение компетентных клеток.
2.3.3. Среды и буферы
2.4. Субклеточное фракционирование.
2.5. Аналитические методы
2.5.1. Анализ разложения Рп.
2.5.2. Определение активности щелочной фосфатазы
2.5.3. Определение фосфолипидного состава мембран.
2.5.4. Электрофорез белков
2.5.5. Определение концентрации белка.
2.5.6. Определение ортофосфата
2.5.7. Определение общего фосфора.
2.6. Облучение клеток УФ
2.7. Электронная микроскопия тонких срезов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разложение метилфосфоната различными штаммами . i
3.2. Адаптация клеток . i к Рп
3.2.1. Влияние Рп на адаптацию
3.2.2. Влияние температуры на адаптацию к Рп
3.3. Селекция и характеристика клеток, адаптированных к Рп
3.3.1. Гетерогенность популяции и селекция адаптированных клеток.
3.3.2. Разложение Рп адаптированными клетками.
3.3.3. Физиологическая, биохимическая и морфологическая характеристики адаптированных клеток.
3.4. Физиологические и биохимические факторы, влияющие на разложение Рп различными штаммами . i
3.4.1. Влияние аэрации на разложение Рп.
3.4.2. Влияние среды на разложение Рп
3.4.3. Влияние концентрация Рп на разложение Рп.
3.4.4. Влияние возраста культуры на разложение Рп.
3.4.5. Влияние концентрации клеток на разложение Рп.
3.4.6. Влияние УФ облучения на разложение Рп
3.4.7. Влияние проницаемости мембран на разложение Рп.
3.5. Разложение Рп рекомбинантными штаммами . i.
3.6. Выявление белков СР лиазного комплекса продуктов ркпОННКЬМЫОР генов и их локализация в клетке
3.7. Заключение
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В отличие от ферментов, разлагающих фосфонаты с активированной СР связью такие как фосфоноацетат и аминоэтилфосфонат, которые выделены и хорошо охарактеризованы, функционирование СР лиазаы выявлено только в интактных клетках. Обнаружить ее активность в бесклеточных экстрактах пока достоверно не удалось. Поэтому фермент до сих пор не выделен и не изучен, а механизм разложения алкилфосфонатов по СР лиазному пути не известен и мало понятен, являясь лишь предметом теоретических дискуссий. Поиск путей биодеградации алкилфосфонатов с прямой связью СР и понимание молекулярных механизмов этого процесса является актуальной проблемой физикохимической биологии, исследование которой необходимо и для решения практических задач биотехнологии защиты окружающей среды. Потребность в решении этих задач возросла в связи с всемирной программой уничтожения химического оружия, в состав которого входят и соединения с СР связью. Сказанное определяет как теоретическую, так и практическую значимость исследования проблемы разложения алкилфосфонатов бактериями. Состояние проблемы. i . , . . . Однако особенно большой интерес к процессу деградации Рп возник лишь в последние годы в связи с экологическими проблемами и с задачами ликвидации химического оружия. До недавнего времени исследователи уделяли внимание лишь скринингу микроорганизмов, способных разлагать алкилфосфонаты, типичным представителем которых является метилфосфонат Рп, а также изучению генетической характеристики системы. В результате выявлены микроорганизмы способные к деградации Рп i , iii . i . Проведено картирование и молекулярное клонирование i генов, ответственных за С лиазную активность и разложение Рп у . i, i , и у ii . Показано, что за использование фосфонатов клетками . . i, а экспрессия некоторых из этих генов контролируется регулоном и экзогенным ортофосфатом . Эти данные являются основой для изучения различных аспектов проблемы, ранее практически не рассматривавшихся. Так локализация СР лиазы в клетке, специфичность этого фермента и механизм его действия практически неизвестны, а немногочисленные попытки обнаружить СР лиазную активность i vi пока не увенчались успехом . . , . Однако иденитифицировать С лиазную активность i vi, понять механизм разложения алкилфосфонатов по С лиазному пути невозможно без знания физиологической и биохимической регуляции этого процесса в клетках бактерий. Оно позволило бы так же оптимизировать процесс разложения и послужило бы основой для развития биотехнологий детоксификации этих соединений в окружающей среде. Однако скольконибудь систематических исследований в этой области до сих пор не проводилось. Цель настоящей работы выявить физиологические и биохимические особенности разложения алкилфосфонатов бактериями на примере грамотрицательной бактерии ii i. У этой бактерии впервые была выявлена способность разлагать метилфосфонат Рп и хорошо изучена генетическая система, контролирующая этот процесс. Рп различными штаммами Е. Рп различными штаммами Е. Рп рекомбинантными штаммами Е. С лиазного комплекса и изучение их локализации. Научная новизна работы. Большинство данных, полученных в настоящей работе, является новыми. Впервые показано, что длительный латентный период при выращивании клеток на среде, содержащей Рп в качестве единственного источника фосфора, связан с адаптацией клеток к Рп, которая подробно изучена. Показано, что адаптация происходит эффективнее при С, чем при С, но не зависит от концентрации Рп и сопровождается изменением физиологических и морфологических характеристик клеточной популяции. Впервые проведена селекция адаптированных клеток, что существенно повышает скорость разложения Рп и рост клеток на этом субстрате. Выявлены новые факторы, влияющие на разложение Рп клетками Е. среды и УФлучи.