Факторы, влияющие на взаимосвязь агрегации и каталитической активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

• Автор: Шалова, Ирина Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
И-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа: структура, свойства и
функции
Структура глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Механизм дегидрогеназной реакции
Многофункциональность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Участие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в развитии
нейродегенеративных заболеваний
Синтетические полиэлектролиты и их поликомплексы
Основные свойства полиэлектролитных комплексов
Основные свойства белок-полиэлектролитных комплексов
Применение синтетических полиэлектролитов в биотехнологии
Болезнь Альцгеймера: общие представления и основные подходы к
лечению
Общие представления о болезни Альцгеймера
Стадии развития болезни Альцгеймера и основные свойства пептида (3амилоида
Современные подходы к лечению болезни Альцгеймера
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Методы
Выделение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц
кролика
Приготовление экстрактов ткани мозга
Определение концентрации реагентов

Определение концентрации белков
Определение активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Инкубация глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы с препаратами,
индуцирующими болезнь Альцгеймера
Модификация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы глутаровым
альдегидом
Приготовление растворов полиэлектролитов
Термоинактивация глицеральдггид-З-фосфатдегидрогеназы в смесях с
полиэлектролитами
Реактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при разрушении
белок-полиэлектролитного комплекса увеличением ионной силы
Реактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при разрушении белок-полиэлектролитного комплекса полиэлектролитом-конкурентом

Кинетика агрегации белка
Метод динамического светорассеяния
Метод дифференциальной сканирующей калориметрии
Электрофорез белков по методу Лэммли
Метод иммуноблоттинга
Статистический анализ данных
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изменение удельной активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в мозге животных при моделировании болезни
Альцгеймера
Кросс-реактивность антител 6Е10, выработанных на /3-амилоид, с
глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназой
Определение удельной активности и содержания глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы в мозге животных
Влияние синтетических полиэлектролитов на термоагрегацию и термоинактивацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Факторы, влияющие на термоагрегацию глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы в смеси с полиэлектролитами
Влияние соотношения заряженных групп белка и полиэлектролита на
термоагрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Влияние степени полимеризации полиэлектролита на термоагрегацию
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Влияние плотности заряда цепи полиэлектролита на термоагрегацию
глицерал ьдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Влияние гидрофобности цепи полиэлектролита на термоагрегацию
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Влияние ионной силы раствора на термоагрегацию глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы
Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Реактивация фермента, участвующего в комплексообразовании 10]
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
сефадексом G-100 (Hill et al., 1975). Колонку (2x68 см) уравновешивали 10 мМ калий-фосфатным буфером, pH 7,5, содержавшим 100 мМ (NH^SO^ 1 мМ ЭДТА, 0,2 мМ ДТТ. Осадок белка после третьей перекристаллизации (половину всего количества) растворяли в минимальном объёме калий-фосфатного буфера и наносили на колонку. Белок элюировали вышеуказанным буфером при скорости тока 0,7 мл/мин, собирая фракции по
3,5 мл. ГАФД элюировалась в первом белковом пике. Фракции с наибольшей активностью объединяли и проводили кристаллизацию добавлением сухого сульфата аммония, поддерживая pH белкового раствора около 8,0. Через 2-3 дня суспензию центрифугировали при 20000 g в течение 60 минут, и полученный осадок суспендировали в небольшом количестве раствора сульфата аммония (383,5 мг/мл (NH^SQt, содержавшего 5 мМ ЭДТА) до получения густой суспензии белка. Выделенный фермент имел удельную активность 120 ед/мг белка и отношение А28о/А2бо= 1,1- Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH^SCV
Чистоту препарата выделенного фермента анализировали с помощью электрофореза по методу Лэммли (Laemmli, 1970).
Выделенный препарат ГАФД перед началом работы подвергали обессоливанию методом гель-фильтрации. Колонку (0,6x8,2 см) с носителем сефадекс G-50 уравновешивали необходимым буферным раствором. Белок растворяли в 0,4 мл того же буфере, наносили на колонку и собирали фракции по 0,5 мл. Концентрацию белка в полученных фракциях определяли спектрофотометрическим методом.
Приготовление экстрактов ткани мозга
Мозговую ткань, замороженную при -70°С, гомогенизировали в течение 30 сек при помощи гомогенизатора Поттера в 4-х кратном объёме 10 мМ калий-фосфатного буфера, pH 7,5, содержавшего 0,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ