Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении

• Автор: Воробьева, Елена Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

Список использованных сокращений

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы

2. Методы.

2.1. Получение экстрактов белков мозга

2.2. Выделение ГДГ из мозга человека

2.3. Гидрофобная хроматография

2.4. Ионообменная хроматография.

2.5. Аффинная хроматография.
2.6. Адсорбционная хроматография
2.7. Хранение очищенных ферментов.
2.8. Выделение тромбоцитов
2.9. Получение экстрактов белков тромбоцитов
2 Определение концентрации белка.
2 Определение ферментативной активности ГДГ
2 Определение кинетических параметров изоформ ГДГ
2 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия ДСЫаПААГ
2 Двумерный электрофорез
I 2 Вестерниммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением
сигнала.
2 Статистическая оценка данных
2 Получение антисывороток и их тестирование.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Выделение ГДГ из мозга человека
2. Изучение физикохимических свойств изоферментов ГДГ.
2.1 Определение молекулярной массы и изоэлсктрической точки ГДГ1, ГДГН и ГДГШ.
2.2. Изучение гидрофобности ГДГ
2.3. Изучение кинетических параметров изоформ ГДГ
2.4. Изучение температурной зависимости изоформ ГДГ
3. Изучение иммунохимических свойств изоформ ГДГ
3.1. Получение специфичных антител
3.2. Определение органо и видоспецифичности изоформ ГДГ
4. Сравнительное изучение ферментативной активности и содержания по иммунореактивности ГДГ в мозге лиц контрольной группы и при шизофрении.
4.1. Изучение ферментативной активности ГДГ.
4.2. Изучение содержания по иммунореактивности изоформ ГДГ.
5. Сравнительное изучение содержания по иммунореактивности ГДГ в тромбоцитах лиц контрольной группы и при шизофрении.
5.1. Выявление изоформ ГДГ в тромбоцитах крови человека
5.2. Сравнительное изучение содержания ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении.
V. ОБСУЖДЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ.
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
1.ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность


В связи с этими данными, а также данными о нарушении глутаматного медиаторного пути при шизофрении, изучение свойств, содержания, локализации, распределения ГДГ в мозге, одного из ключевых ферментов глутаматного метаболизма в норме и при шизофрении, представляется актуальным. Безусловно, исследования, проведенные на аутопси йном материале, помогают понять механизмы развития заболевания. Однако, поиск соответствующих изменений в работе глутаматергической системы на периферии является важным, поскольку из литературы известно, что тромбоциты, выделенные из крови человека, могут служить удовлетворительной моделью, отражающей процессы, которые происходят в нервной ткани. ФАГ и ГДГ . Таким образом в связи с глутаматергической гипотезой патогенеза шизофрении изучение ГДГ, как в мозге, так и в тромбоцитах человека, при этом заболевании представляется актуальным. Цель и задачи исследования. Целью данной работы является оценка возможного участия ГДГ в нарушении метаболизма глутамата при шизофрении. Выделение ГДГ из ткани мозга лиц, не страдавших психическими или нервными заболеваниями. Характеристика физикохимических свойств ГДГ. Сравнительная оценка уровня активности ГДГ в экстрактах белков различных областей мозга человека в контрольной группе лица, не страдающие неврологическими и психическими расстройствами и при шизофрении. Получение моноспецифичных антител к ГДГ мозга человека. Сравнительное изучение содержания ГДГ в мозге в контрольной группе и при шизофрении. Сравнительное изучение содержания ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении. Научная новизна работы. Да ГДГ1 и кДа ГДГП, и мсмбраноассоциированная изоформа, с молекулярной массой субъединиц кДа ГДГШ. Ферментативная активность ГДГ в экстрактах белков мозга является суммарной активностью растворимых изоформ. Получены специфичные поликлональные антитела к ГДП, ГДГИ и к ГДГШ мозга человека. Методом вестерн иммуноблоттинга установлено, что антисыворотка к ГДП и ГДГИ распознает оба изофермента, в то время как очищенная ассоциированная с мембранами ГДГШ обнаруживается только специфичными к ней антителами, причем перекрестная реакция между легко растворимыми и ассоциированной с мембранами формами практически отсутствует. Адаптирован метод иммуноблотгинга с хемилюминесцентным усилением сигнала и подобраны системы, позволяющие определять уровни всех трех изоферментов ГДГ. Сравнительная оценка содержания иммунореактивных ГДГ1 , ГДГП и ГДГШ при шизофрении и в контрольных случаях в лобной, передней и задней лимбической коре и коре мозжечка проведена с использованием этого метода. Содержание ГДГ при шизофрении в лобной р0. Впервые выявлено достоверное повышение р0. ГДГ в тромбоцитах при шизофрении по сравнению с контрольной группой. Теоретическая и практическая значимость работы. В работе обнаружены и охарактеризованы три изоформы ГДГ мозга человека. Получены специфичные поликлональные антитела, распознающие растворимые и мембранноассоциированную ГДГ. Впервые выявлено изменение содержания ГДГ в отдельных областях мозга при шизофрении по сравнению с контролем. А также впервые обнаружено изменение содержания ГДГ при шизофрении в элементах крови тромбоцитах. Результаты исследования одного из ключевых ферментов глутаматного пути могут быть важными для понимания метаболизма глутамата при патологии нервной системы. Наряду с содержанием кальция, активностью 1 рецепторов, содержание ГДГ в тромбоцитах может являться полезным прижизненным маркером, отражающим статус глутаматергической системы у больных шизофренией. Основные положения, выносимые на защиту. Ферментативная активность ГДГ в экстрактах мозга человека представлена суммарной активностью трех изоформ ГДГ, различающихся по физикохимическим свойствам. Содержание растворимых и мембранноассоциированной ГДГ при шизофрении в лобной, задней лимбической коре, коре мозжечка достоверно повышено р0. Содержание растворимых изоформ ГДГ в тромбоцитах достоверно повышено р0. Предложен способ определения содержания изоформ ГДГ в экстрактах мозга человека и в тромбоцитах крови человека. В основу метода положены электрофорез в ПААГ с ДС, вестерниммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала, сканирование на лазерном денситометре.