Новые методы получения высокоочищенных нуклеаз и нуклеотидов из животного и микробиального сырья

• Автор: Бочков, Денис Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Список сокращений
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Ферменты, содержащиеся в поджелудочной железе животных и методы их выделения
1.1.1. Рибонуклеаза (РНКаза)
1.1.1.1. Получение рибонуклеазы (РНКазы)
1.1.2. Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза)
1.1.2.1. Получение дезоксирибонуклеазы (ДНКазы)
1.1.3. Фермент холестеролэстераза
1.1.3.1. Получение холестеролэстеразы
1.1.4. Фермент трипсин
1.1.4.1. Получение трипсина
1.2. Использование ферментов нуклеазного действия для получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5-монофосфатов и биосинтез их полифосфатов
1.2.1 .Перспективные микробные нуклеазы
1.2.1.1. Перспективный фермент нуклеазного действия - Б'-нуклеаза и технология его выделения
1.2.2. Синтез рибо- и дезоксирибонуклеозид-5 - трифосфатов
1.2.3. Иммобилизация ферментов
1.2.4. Методы модификации сорбентов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка методов получения РНКазы, ДНКазы, трипсина и
холестеролэстеразы из поджелудочной железы крупного рогатого
скота
ф 3.1.1. Получение “грубых” экстрактов ферментов: РНКазы, ДНКазы, трипсина
и холестеролэстеразы
3.1.2. Фракционирование ферментов экстракта поджелудочной железы сульфатом аммония
3.1.2.1. Выделение и анализ холестеролэстеразы
3.1.2.2. Выделение и анализ трипсина
3.1.2.3. Выделение и анализ ДНКазы
3.1.2.4. Получение РНКазы высокой очистки
3.1.2.5. Получение субстрата (РНК) для анализа активности фермента рибонукл еазы
3.1.2.6. Эффективность предлагаемого метода получения ферментов РНКазы, Ф ДНК-азы, трипсина и холестеролэстеразы из поджелудочной железы крупного
рогатого скота
3.2. Новые подходы к синтезу дезоксирибо- и рибонуклеозид^-монофосфатов и их трифосфатов
3.2.1. Получение субстрата ДНК для получения нуклеотидов
3.2.2. Выделение Б’-нуклеазы из микробиологической субстанции
амилоризина
3.2.3.Иммобилизация Б'-нуклеазы
3.2.3.1. Адсорбционная иммобилизация Б’-нуклеазы на углерод минеральных ф неорганических носителях
3.2.3.2. Исследование ковалентной иммобилизации Б’-нуклеазы на силикатных носителях
3.2.4. Гидролиз нуклеиновых кислот ферментом Б'-нуклеазой
3.2.5. Получение и анализ ацетилфосфата лития
3.2.6. Ферментативное фосфорилирование индивидуальных ЫМР
3.2.7. Получение сЮТР и 14ТР сопряжённым фосфорилированием продуктов
гидролиза РНК и ДНК
ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Получение ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и хол естеролэстеразы
4.1.1. Получение субстрата (РНК) для анализа активности фермента рибонуклеазы
4.1.2. Очистка ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы
4.1.3. Электрофоретический анализ чистоты ДНКазы и РНКазы
4.1.4. Определение удельной активности ферментов
4.1.5. Стерилизация, розлив и лиофильная сушка
4.2. Новые подходы к синтезу дезоксирибо- и рибонуклеозид-б^монофосфатов и их трифосфатов
4.2.1. Получение субстрата (ДНК) для ферментов ДНКазы и З1-нуклеазы
4.2.2. Выделение ферментного препарата З’-нуклеазы из амилоризина
4.2.3. Определение активности З^нуклеазы
4.2.4. Иммобилизация З’-нуклеазы
4.2.5. Гидролиз ДНК ферментом З'-нуклеазой
4.2.6. Гидролиз РНК З’-нуклеазой в растворе
4.2.7. Гидролиз РНК иммобилизованной З'-нуклеазой
4.2.8. Последовательный гидролиз ДНК ферментами ДНК-азой и иммобилизованной З'-нуклеазой
4.2.9. Последовательный гидролиз ДНК ферментами ДНКазой и не иммобилизованной 3‘-нуклеазой
4.2.10. Получение и анализ ацетилфосфата лития
4.2.11. Выделение суммарного препарата нуклеотидилкиназ с ацетокиназой
4.2.12. Ферментативное фосфорилирование индивидуальных 1ММР
4.2.13. Ферментативное фосфорилирование ИМР и сПЧМР в смеси
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ

Фосфорилирование дезокси- и рибонуклеозид-5/-монофосфатов проводили суммарным препаратом нуклеотидилкиназ с ацетокиназой. Хроматографическое выделение продуктов фосфорилирования проводили на «Dowex 1:2» в линейном градиенте 0,05-1 М бикарбоната аммония, pH 8,8. Фракцию, соответствующую трифосфату, собирали, замеряли общий объем, упаривали до концентрации 0,15 М бикарбоната аммония. К упаренному раствору добавляли 1/10 объема 2 М НС1. Трифосфаты осаждали десятикратным объемом этилового спирта. Осадок центрифугировали и сушили в эксикаторе под Р2О5. Высушенный препарат анализировали на содержание основного вещества и хроматографическую чистоту.
В работе было использовано следующее оборудование: спектрофотометр СФ - 46 J10MO (Россия), центрифуга Sigma 6К15 (Германия),
ультрафильтрационная установка УПВ-6, укомплектованная разделительными аппаратами типа АР-3-50ПС/15ПА/5ПА производства г. Кириши (Россия), лиофильная сушка LioPro-3000 ID: 88872244 (HETO-HOLTEN A/S фирма Jouan Nordic); Uvicord S 2 LKB 2238 (Швеция); испаритель ротационный ИР - 1 М 2 (Россия); прибор для вертикального электрофореза (стёкла 13 х 15 см), кондуктометр «Анион-7020» диапазон измерения: 1мкСм/см - 100 мСм/см. (Россия).