Выделение, очистка и свойства бета-амилазы Bacillus Polymyxa N 3

• Автор: Рашап, Рима Куснельевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Вильнюс
• Количество страниц: 112 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Продуценты амилазы

2. Выделение и очистка бактериальной дамилазы

3. Методы, основанные на специфической сорбции

амилаз крахмалом

4. Физикохимические свойства бактериальных дамилаз

5. Возможности практического применения Дамилазы

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Культивирование i x ИЗ
2. Очистка амилазы
2.1. Получение технического препарата дамилазы
2.2. Получение высокоочищенного препарата дамилазы
2.2.1. Разработка состава сорбента
2.2.2. Разработка условий сорбциидесорбции
а сорбционная емкость кукурузного крахмала
б геометрия колонки
в температура сорбции и десорбции
г условия десорбции и концентрация
в растворе
2.2.3. Очистка дамилазы методом специфической
сорбции на крахмале
2.2.4. Очистка дамилазы методом осаждения комплекса ферментсубстрат
2.2.5. Обессоливание растворов дамилазы методом гельфильтрации
2.2.6. Концентрирование растворовдамилазы
2.2.7. Изоэлектрическое фокусирование
3. Анализ продуктов гидролиза крахмала
3.1. Бумажная хроматография
3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография
4. Методы определения ферментативной активности
4.1. Определение амилолитической активности
4.2. Определение протеолитическбй активности
5. Определение концентрации белка
6. Изучение свойств уьамилазы
6.1. Определение молекулярной массы
6.1.1. Дискэлектрофорез в присутствии додецилсульфата натрия
а окрашивание гликопротеидов
6.1.2. Седиментационный анализ
6.2. Определение аминокислотного состава
6.3. Определение карбогидратов
6.4. Изучение зависимости активности дамилазы
от и температуры
6.5. Изучение стабильности дамилазы
6.6. Определение Эфф
6.7. Изучение субстратной специфичности
7. Реагенты
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ
1. Получение технического препарата амилазы.
2. Получение высокоочищенного препарата
2.1. Разработка состава сорбента
2.2. Условия сорбциидесорбции Дамилазы
2.3. Очистка бактериальной амилазы
2.4. Изоэлектрическое фокусирование
3. Свойства изоформ амилазы
3.1. Гомогенность и молекулярная масса
3.2. Аминокислотный состав
3.3. Углеводный состав
3.4. Влияние на активность и стабильность
3.5. Влияние температуры на активность и стабильность
3.6. Субстратная специфичность и продукты гидролиза
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


О существовании бактерийпродуцентов амилазы впервые сообщалось в году 4. Однако, целевые поиски продуцентов для промышленного производства бактериальной уЗамилазы начались лишь в ых годах , , , 8. Значительных результатов в этой области добились японские ученые , , , , , III8, 58. В настоящее время для производства мальтозы из крахмала в Японии, США, Англии, Франции, ФРГ, Швеции применяется бактериальная амилаза . Выход основного продукта по большинству методик достигает . В то же время, в нашей стране мальтозу получают методом осахаривания крахмала солодовым экстрактом. Технологический процесс осложняется образованием глюкозы, декстринов и других побочных продуктов. В году во ВНИИ Прикладной энзимологии был отобран продуцент Дамилазы i x 3 . Это создало реальное основание для создания производства отечественной бактериальной дамилазы. Разработка достаточно эффективного метода выделения и очистки бактериальной дамилазы. Изучение основных физикохимических свойств полученной дамилазы, необходимых для ее квалифицированного применения. Для решения поставленных задач разработаны методики получения технического и высокоочищенного препаратов Дамилазы. Технический препарат амилазы получали фракционированием органическими растворителями. Схема получения высокоочищенного препарата состоит из двух специфических стадий очистки сорбциидесорбции на кукурузном крахмале и осаждение комплекса амилазагликоген этанолом. Детально разработана методика сорбциидесорбции на кукурузном крахмале в динамическом режиме первая стадия . Показано, что десорбция рамилазы с крахмала происходит вследствие ингибирования фермента продуктом реакции мальтозой. Для очистки амилазы впервые применен метод осаждения ферментсубстратного комплекса вторая стадия . В полученном после двух стадий очистки препарате методом изоэлектрического фокусирования обнаружено наличие двух изоформ. Определены их молекулярные массы, аминокислотный состав, углеводный состав, оптимум. Изучена зависимость активности изоформ от температуры, а также зависимость их стабильности от и температуры. Определены основные продукты гидролиза субстрата. На основании всей совокупности экспериментальных данных сформулирован вывод, что изоформы уЗамилазы из i ро1унуха Ю представляют собой индивидуальные белки, отличающиеся по таким физикохимическим характеристикам как аминокислотный и углеводный состав, молекулярная масса, изоэлектрические точки. ГЛАВА I. В году К. С.Кирхгоф сообщил о выделении из пшеничной муки вещества, обладающего способностью уменьшать вязкость крахмального клейстера и образовывать сахар. Активное вещество, содержащееся в клейковине пшеничной муки, он выделил, сохранив его осахаривающую способность, фильтрованием осахаренного раствора. Наличие сходного вещества было установлено и в экстракте ячменного солода . Пайен и Персо в году из ячменного солода извлекли осахаривающий агент, названный ими диастазой. В продуктах превращения крахмала действием диастаза они нашли два вещества сахар и декстрин 5. М. ОСалливэн в году установил, что этот сахар является мальтозой. Задолго до выделения диастазы специалисты пивоварения различали в солоде способность к разжижению и способность к осахариванию. Причем, осахаривающая способность солода снижалась с повышением температуры. В году М. Мэркер высказал гипотезу, которую позже уточнил М. Дюбрюнфо, о том, эти два процесса зависят от влияния двух различных энзимов. М.Кюизинье назвал их мальтазой и декстриназой. М.Вийсман в году разделял эти два фермента методом диффузии в желатине 5. По его сообщениям мальтаза более чувствительна к повышению температуры, чем декстриназа. Э.Ольсон в году подтвердил существование в ячмене двух амилаз декстриназы и сахарогеназы. Первую он назвал с4амилазой, а вторую амилазой, так как в результате действия последней происходит гидролиз 1,4гликозидных связей крахмала с образованием дмалыгозы. По принятой в настоящее время Номенклатуре ферментов Дамилаза К. Ф. 3.