Изучение стабильности и сворачивания белков : На примере убиквитина и пероксидазы

• Автор: Ермоленко, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ВКЛАД ПОВЕРХНОСТНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В

СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКА.

1.1. Взаимодействия поверхностных аминокислотных остатков, важные для

стабильности

1.2. Поверхностные остатки и образование вторичной структуры.

1.3. Аминокислотные замены в петлях и поворотах основной цепочки.

1.4. Взаимодействие заряженных аминокислот на поверхности белка. Солевые

мостики
1.5. Гидрофобные остатки на белковой поверхности и обратный гидрофобный
эффект.
ГЛАВА 2. ПОВЕРХНОСТНЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ И ФОЛДИНГ
БЕЛКОВ.
2.1. Сопряжение связывания и сворачивания для неструктурированных
белков
2.2. Влияние антител на сворачивание.Г.
ГЛАВА 3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ
ОБЪЕКТОВ УБИКВИТИНА И ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА
3.1. Термодинамическая стабильность и фолдинг убиквитина.
3.2. Фолдинг пероксидазы хрена.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4.1. Материалы.
4.2. Методы
4.2.1. Мутагенез и экспрессия мутантных вариантов убиквитина.
4.2.2. Измерение термодинамической стабильности вариантов убиквитина
с помощью микрокалориметрии
4.2.3 Измерение спектров кругового дихроизма КД
4.2.4 Получение и очистка моноклональных антител против пероксидазы хрена.
4.2.5 Денатурация и ренатурация пероксидазы хрсыа
4.2.6 Измерение каталитической активности пероксидазы
4.2.7 Конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ
4.2.8 Титрование апопероксидазы хрена гемом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА 5. ЭФФЕКТ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН НА ПОВЕРХНОСТИ
УБИКВИТИНА НА СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКА
5.1. Экспериментальная стратегия исследования вклада поверхностных остатков
в стабильность убиквитина.
5.2. Вклад разной способности аминокислот образовывать аспираль в
стабильность убиквитина.
5.3. Гидрофобные взаимодействия на частично экспонированных позициях на
поверхности убиквитина
ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ НА СВОРАЧИВАНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ
ХРЕНА.
6.1 Сворачивание пероксидазы хрена в присутствии моноклональных антител
6.2 Причины неполного восстановления каталитической активности пероксидазы
при ренатурации.
6.3 Возможный механизм увеличения выхода ренатурации пероксидазы в
присутствии антител.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Таким образом, позитивные и негативные в энергетическом плане факторы практически компенсируют друг друга, в результате чего термодинамическая стабильность белка составляет порядка кДжмоль, а зачастую и меньше. Поэтому даже слабые взаимодействия аминокислот с энергией порядка нескольких кДжмоль могут существенно влиять на стабильность белка. В соответствии с одним из широко используемых определений, спрятанными считаются аминокислотные остатки, у которых менее чем 5 поверхности доступно для растворителя остальные соответственно считаются поверхностными . В маленьких глобулярных белках спрятанные остатки составляют в среднем всего около от общего числа аминокислот, в белках большего размера около . Таким образом, не менее 23 аминокислотных остатков в белках более или менее экспонированы на поверхности. Роль в сворачивании и стабильности белка такой значительной доли аминокислот только недавно стала предметом детального изучения. Так, на разных белковых и пептидных системах было экспериментально показано, что аминокислоты различаются по способности образовывать элементы вторичной структуры. Глицин или аминокислоты с 3разветвленной боковой цепочкой дестабилизируют аспираль на экспонированных на поверхности позициях по сравнению с аланином . Было продемонстрировано, что взаимодействие заряженных остатков на поверхности белка может существенно влиять на стабильность белка . По крайней мере в некоторых случаях гидрофобные аминокислоты на поверхности поразному экспонированы в нативном и развернутом состоянии. Неполярные остатки могут образовывать стабилизирующие гидрофобные контакты в нативной структуре белка н дестабилизирующие гидрофобные кластеры в развернутом состоянии. Поэтому замены на поверхности гидрофобных остатков на полярные или полярных на гидрофобные в некоторых случаях также изменяют термодинамическую стабильность белка . В сворачивании белков важную роль может играть их поверхность. Большое число белков в клетке слабо структурированы в свободном состоянии и сворачиваются в высокоупорядоченную структуру только во время связывания с другим белкомлигандом . Таким образом, поверхностные остатки, участвующие в связывании, оказываются ключевыми для сворачивания. Перечисленные выше факторы, определяющие важность поверхностных остатков для сворачивания и стабильности белка, будут рассмотрены подробнее в последующих разделах литературного обзора. С момента появления первых кристаллографических данных о структуре белка было отмечено, что одни аминокислоты, такие как аланин, лейцин, глутамин, встречаются в аспирапях часто, другие, такие как пролин, глицин или аспарагин, довольно редко . Разными группами исследователей были выведены несколько писал, отражающих тенденцию разных аминокислот образовывать вторичную структуру i, на основании которых были предложены алгоритмы предсказания вторичной структуры белка по его аминокислотной последовательности . Разная тенденция аминокислот образовывать вторичную структуру была подтверждена экспериментально в ряде работ. Несмотря на различия в деталях модельной системы, общий подход заключался в синтезе идентичных пептидов, различающихся только в одной позиции в центре спирали, где поочередно включались все двадцать природных аминокислот, с последующим определением стабильности спирали . Такие эксперименты позволили оценить различия в тенденции образовывать вторичную структуру между аминокислотами в терминах свободной энергии сворачивания спирали. Подобная стратегия была применена также для белков, где остаток, экспонированный на белковой поверхности в центре аспирали, заменялся на другие аминокислоты с помощью методов белковой инженерии . Шкалы тенденции образования аспирали, выведенные в работах , на основании экспериментов с интактным белком, рибонукпеазой Т1 и членным пептидом с последовательностью, идентичной спирали в одноименном белке, практически совпадали друг с другом. Для экспериментов, выявляющих тенденцию образовывать вторичную структуру для разных аминокислот, было принципиально важным выбрать остаток, полностью экспонированный на поверхности белка.