Влияние вольфрама на нитратредуктазу солетолерантных дрожжей Rhodotorula glutinis

• Автор: Носиков, Александр Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ. .

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Нитратредуктаза структура, свойства и механизм действия

1.1.1. Молибдокофактор, его структура. Различные типы молибдокофактора.

1.2. Ассимиляция нитратов у дрожжей.

1.3. Вольфрам в биологических системах

1.3.1. Химическая природа вольфрама и сравнение его смолибденов.

1.3.2. Биологическое действие вольфрама

1.3.3. Вольфрамовые ферменты.

1.3.4. Активный центр вольфрамсодержащих ферментов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследований
2.2. Характеристика культуры дрожжей ii
2.3. Условия выращивания дрожжей . ii.
2.4. Получение бесклеточного экстракта
2.4.1. Разрушение меток с использованием камеры Любимова
2.4.2. Разрушение клеток в гомогенизаторе
2.4.3. Разрушение клеток на ультразвуковом дезинтеграторе
2.4.4. Сравнение различных методов разрушения
2.5. Определение нитратредуктазной активности.
2.6. Активирование нитратредуктазы
2.7. Определение активности молибдокофактора
2.7.1. Условия выращивания мутанта i1.ЗО
2.7.2. Приготовление экстракта мутанта . i1.
2.7.3. Проверка чистоты полученного препарата
мутанта . i1.
2.7.4. Процедура определения активности молибдокофактора
2.8. Определение белка по методу Бредфорд
2.9. Определение вольфрама кинетическим методом
2.9.1. Оптимизация условий приготовления образцов содержащих
белков для последующего определения в них вольфрама.
2 Определение вольфрама массспектрометрическим методом
2 Определение молекулярной массы нитратредуктазы.
2 Нативный дискэлектрофорез.
2 Определение субъединичного состава нитратредуктазы.
2 Другие методы, использованные в работе.
2 Реактивы, используемые в работе
Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Стимуляция роста и нитратредуктазной активности солетолерантных дрожжей . ii вольфрамом в присутствии молибдена
3.2. Влияние высоких концентрации вольфрамита в питательной
среде на рост дрожжей .i
3.3. Гельхроматография экстракта из клеток дрожжей
. ii на колонке i
3.4. Выделение и очистка нитратредуктазы из дрожжей . ii
3.5. Характеристика, свойства выделенной нитратредуктазы.
3.6.Влияние содержания аммонийного азота в среде на уровень нитратредуктазной активности у дрожжей . ii.
3.7.Сравнительная характеристика нитратредуктаз из солетолерантных дрожжей . ii, выращенных на среде с
1 мМмолибдата и на среде с 1 мМ вольфрамита
3.8. Защитные механизмы, существующие в дрожжевой клетке и
снижающие концентрацию в пей вольфрама.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Сравнительная характеристика нитратредуктаз из солетолерантных дрожжей . СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. Актуальность темы. В течение лет молибден считался единственным элементом из числа тяжелых металлов и из всех элементов пятого периода, который природа выбрала в качестве важного микрокомпонента для построения живых организмов. Его биологическая роль определяется прежде всею тем, что он входит в сослав ферментов к настоящему времени их насчитывается более , участвующих в метаболизме азота, серы, углерода. Наибольшее внимание уделялось молибдену как компоненту активных центров нитрогеназы и нитратредуктазы ферментов, осуществляющих ассимиляцию молекулярного и нитратного азота. Вольфрам обладает сходными с молибденом физическими и химическими свойствами. До открытия активных вольфрамсодержащих IVсодержащих ферментов предполагалось, что, в силу этого сходства, вольфрам способен заместить молибден в молибдоферментах, при сохранении ферментативной активности. Данную особенность можно было бы использовать для изучения роли металла в каталитическом процессе. По все попытки выделить активный Присутствие вольфрама в среде роста в микромолярных концентрациях без добавления молибдена приводило к ингибированию роста организма за счет образования малоактивных или неактивных вольфрамовых аналогов Мосодержащих ферментов. Таким образом, несмотря на высокую степень сходства между двумя металлами, молибден оказывался более предпочтительным, чем вольфрам. Поэтому долгое время вольфраму отводилась лишь роль антагониста молибдена. Наиболее изученным ферментом, с точки зрения ингибирующего влияния вольфрама, является нитратредуктаза. Поэтому рост организма в таких условиях, повидимому, должен указывать на синтез активной IVсодержащей нитратредуктазы. В то же время было обнаружено, что одновременное присутствие в среде роста вольфрама и молибдена, стимулирует рост и нитратредукгазную активность у шпината, цветной капусты, белого клевера, у некоторых бактериальных организмов. При этом вольфрам в акгивный центр Мосодержащих ферментов не включался, что еще раз подчеркивало предпочтительность молибдена. Обнаруженные за последнее десятилетие акгивные IVсодержащие ферменты из гипертермофильных архебактерий послужили основой для доказательства биологической роли вольфрама. У данной группы микроорганизмов как рост, так и каталитическая активность некоторых ферментов облигатно зависела от вольфрама, что дает нам право говорить о истинных Данные, об обнаружении активных вольфрамовых ферментов из эукариот, отсутствуют. В данной работе были использованы солетолерантные дрожжи ЕИосоЮпа Шпь выделенные из эпифитной микрофлоры сольэкскретирующих листьев Агрех штиз, растущего в пустыне Негев Израиль. Можно было предполагать, что у организма, адаптированного к сравнительно высоким концентрациям соли, процесс нитратредукции можег осуществляться ферментом, отличающимся от обычных, описанных в литературе молибденсодержащих нитратредуктаз. Данная работа посвящена изучению нитратредукции у солетолерантных дрожжей Я. Цель и задачи исследования. Главной целью исследования явилось изучение особенностей ферментативного пути ассимиляции нитратов у солетолерантиых дрожжей НЬос1оот1а Нм, растущих в условии высокой концентрации вольфрамата натрия. Изучение влияния совместною присутствия вольфрамата и молибдата натрия на рост и нитратредуктазную активност ь у дрожжей Я. Выделение и изучение нитратредуктаз из дрожжей, выращенных на 1 мМ вольфрамата при дефиците молибдена, и сравнение ее с нитратредуктазами из тех же клеток, выращенных на 1 мМ молибдата. Научная новизна. Обнаружено стимулирующее действие вольфрама на рост и нитратредуктазную активность у дрожжей Я. Разработана модификация высокочувствительного кинетического метода определения вольфрама в белках. Практическая ценность работы. Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о положительном влиянии вольфрамата натрия на рост и ИР активность у некоторых растений и микроорганизмов.