Биосинтетическое сворачивание белков

• Автор: Федоров, Алексей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 300 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Ренатурация белков.

Котрансляционное сворачивание белков

Ранние стадии сворачивания белка, происходящие котрансляционно

Связывание кофакторов и лигандов

Поздние стадии процесса сворачивания и формирование олигомерных

структур

Ферменты, катализирующие сворачивание.

Роль рибосом в сворачивании.

Неравномерность скорости трансляции и котрансляционное сворачивание
Кинетика и эффективность биосинтетического сворачивания, его
моделирование.
Пермутированные белки и котрансляционное сворачивание.
Молекулярные шапероны в котрансляционном сворачивании.
Молекулярные шапероны.
Система Н8Р.
Система НБРбО шаперонины
Шаперонины и иммунная система.
Существует ли эволюционный сдвиг от посттрансляционного сворачивания белков к котрансляционному при переходе от прокариот к эукариотам. Заболевания, вызываемые или ассоциированные с неправильно
свернутыми белками
Белки оболочки вируса гепатита С
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Бесклеточные системы экспрессии.
Конструирование плазмиды, генов и их фрагментов.
3 субъединица триптофансинтазы Е. соИ.
3 субъединица люциферазы.
Центрифугирование бссклеточных систем экспрессии в градиенте
концентрации сахарозы.
Выделение рибосомной фракции из бесклеточных систем экспрессии
Иммуноадсорбция полипептидов из систем экспрессии.
Определение равновесной константы связываниядиссоциации антитела с
полипептидом из бесклеточной системы трансляции.
Определение компактности структуры полипептидов методом гель
фильтрации
Измерение биолюминесцснтной активности
Методы электрофоретического разделения белков.
Анализ абсолютной радиоактивности, детектируемой на бетаимеджере
ЛАЛ тест
Иммобилизация денатурированного яичного альбумина на агарозе
Определение иммунологической активности антигенов на мышах
Животные
Иммунизация.
Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ ИФА.
Культура клеток.
Проточная цитофлуориметрия
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Котрансляционное сворачивание белков
Ранние стадии сворачивания белка, проходящие котраисляционно
,Кинетика котрансляционного сворачивания.
Кинетика котрансляционного сворачивания
Влияние котрансляционного этапа на кинетику биосинтетического
сворачивания белка.
Путь сворачивания 3 субъединицы люциферазы при биосинтетическом процессе. Его сравнение с путем сворачивания из денатурированного
состояния
Котрансляционное сворачивание белков и его физический смысл
Биосинтетическое сворачивание белков и молекулярные шапероны.
Взаимодействие синтезируемых полипептидов с молекулярными
шаперонами.
Шаперон вгоЕК модулирует кинетику распределения сворачивающихся полипептидпых интермедиатов между альтернативными формами белка,
максимально увеличивая выход биологически активного белка
Обобщенная схема действия шаперонов
Быстрый и медленный пути биосинтетического сворачивания
субъединицы бактериальной люциферазы.
Адаптация процесса биосинтетического сворачивания белков в заданном
окружении в клетках. Гипотеза
Структурнофункциональный анализ синтезированных белков
Локализация антигенных детерминант с использованием растущих
полипептидов на рибосомах
Измерение истинной константы связывания полипептидов.
с моноклональными антителами и лигандами.
Изучение структуры альбебетина, белка с заданной пространственной
структурой.
Структурнофункциональный анализ белков оболочки вируса гепатита С
Возможность создания субъединичной противотуберкулезной вакцины на основе молекулярного шаперона М. i
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Научная новизна диссертационной работы
Практическая значимость диссертационной работы
Апробация работы
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Очень важно, что для самого большого фрагмента , представляющие полную полипептидную цепь, за исключением крайних Сконцевых аминокислот, закрытых рибосомой, все антитела взаимодействовали с константами, близкими к таковым для нативного тримера, а для нескольких антител константы были даже выше v , . Приобретение серединным бетаструктурным доменом элементов структуры нативного белка в ходе синтеза подтвердило ранее полученные такие же качественные результаты этими авторами , i, . Еуапя е а1у , когда авторы освободили исследуемые полипептидные фрагменты из рибосомных комплексов и снова определили их взаимодействие с антителами. Вопервых, основная часть фрагментов быстро агрегировала. Для оставшихся растворимых полипептидных цепей антитела продолжали реагировать с константами, сходными с рибосомосвязанными вариантами. Какие элементы структуры характерны для исследуемых укороченных фрагментов, если их сразу экспрессировать как варианты со стоп кодоном на мРНК, а затем ренатурировать из полностью денатурированного состояния Авторы проделали такую работу, изза сильной агрегации им удалось получить только наиболее длинный из укороченных фрагментов, фрагмент . Оказалось, что антитела к Ыконцевому домену продолжали прочно взаимодействовать с фрагментом, а антитела к бетаструктурному домену показывали низкую афинность или вообще не реагировали. Чтобы подтвердить напрашивающийся вывод, что процесс ренатурации приводит к появлению другой структуры, этот фрагмент и его рибосомосвязанный аналог были подвергнуты протсолизу. Хотя общая устойчивость сравниваемых вариантов была схожа, у рибосомосвязанного полипептида выявлялся кДа фрагмент, устойчивый к протсолизу, у ренатурированного же он отсутствовал. Разницу в структурах авторы связали, в первую очередь, с бетаструктурным доменом и сделали вывод, что для эффективного сворачивания, обеспечиваемого в биосинтетическом процессе, бетаструктурный домен должен достаточно рано, до завершения процесса синтеза, приобрести нагивоподобную структуру. Это позволяет избежать агрегации, практически неизбежной при ренатурации белка. Помимо прочего, в ходе биосинтетического сворачивания экспонированные гидрофобные участки бетаструктурного домена, видимо, могут экранироваться рибосомой, до появления его нативоподобной конформации. В заключение, авторы показали, что шапероны не влияли на процесс котрансляционного сворачивания см. Связывание кофакторов и лигандов происходит после формирования белками нативной или промежуточной структуры, в любом случае наличие определенной структуры белка является необходимым для связывания Связывание кофакторов и лигандов часто стабилизирует белковые структуры и может влиять на их пути сворачивания. Белок из реакционного центра хлоропластов связывает сразу несколько кофакторов. Было показано, что связывание кофакторов происходит во время синтеза и транслокации белка в мембрану тилакоидов i , . Для синтеза полноразмерного белка и предотвращения его деградации требовалось котрансляционное связывание хлорофилла , . В экспериментах, проводившихся с радиоактивной пульсовой меткой полипептидов в хлоропластах, в условиях отсутствия хлорофилла накапливались промежуточные полипептиды от до кДа. В присутствие хлорофилла эти полипептиды синтезировались до полноразмерного белка. Эффект хлорофилла на стабильность белка был связан как с котрансляционным этапом во время синтеза, так и со стабилизацией синтезированного белка 1 i , . Гликозилирование гемагглютинина вируса гриппа происходит в люмене эндоплазматического ретикулума. Блокирование гликозилирования растущих цепей белка приводило к нарушению процесса сворачивания и образованию агрегатов , . В бссклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика изучалось связывание гема а глобином , , . Вопервых, оказалось, что гем оказываегся ассоциированным с полирибосомами , . Затем было определено связывание гема с различными концевыми рибосомосвязанными фрагментами глобина, от до 0 аминокислотных остатка. Оказалось, что гем может связываться с растущими цепями а глобина при достижении ими длины в аминокислотных остатка , .