Разработка подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты с помощью тандемных систем производных олигонуклеотидов

• Автор: Гайдамаков, Сергей Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 116 с. : ил.

Содержание
Содержание
Список сокращений
Введение
Гдава 1. Применение олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных для изучения и регуляции экспрессии генов (обзор литературы)
1.1. «Антисенс»-стратегия: воздействие на мРНК с использованием антисмысловых олигонуклеотидов и их производных
1.2. «Антиген»-стратегия: использование олигонуклеотидных производных для воздействия на регуляторные элементы или факторы транскрипции
1.3. Фотореакционноспособные олигонуклеотидные производные как инструмент для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты
1.4. Олигонуклеотидные производные, содержащие псорален
1.5. Взаимодействие фотоактивируемых производных олигонуклеотидов с регуляторными районами генов
1.6. Взаимодействие фотоактивируемых производных олигонуклеотидов с факторами транскрипции
1.7. Использование фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов для направленного мутагенеза
1.8. Использование фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов для воздействия на ДНК в составе хромосом
1.9. Олигонуклеотидные производные, содержащие нтеркалирующие красители
1.10. Олигонуклеотидные производные, содержащие азиды и перфторированные азиды, использование эффекторов для повышения степени модификации
1.11. Взаимодействие олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных с нуклеиновыми кислотами - мишенями в составе тандемных комплексов
1.12. Безизлучательная передача энергии между флуорофорами, присоединенными к олигонуклеотидам
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Ферменты
2.2. Реактивы
2.3. Плазмиды, бактериофаги и штаммы микроорганизмов
2.4. Олигонуклеотиды
2.5. Субклонирование фрагментов ДНК
2.6. Выделение бактериофагов и их одноцепочечной ДНК
2.7. Выделение ДНК плазмид и ЮР-формы бактериофага М13 из клеток Е.соИ методом осветленного лизата с последующим центрифугированием в двухступенчатом градиенте хлористого цезия
2.8. Приготовление препаратов плазмидной ДНК с разной степенью суперспирализации
2.9. Метод геномного секвенирования
2.10. Получение алкилирующих производных смеси олигонуклеотидов
2.11. Алкилирование ДНК адресованными реагентами
2.12. Получение фотоактивируемых реакционноспособных производных олигонуклеотидов Ол2Я2 и ОлЗШ
2.13. Выделение олигонуклеотидных производных методом ВЭЖХ
2.14. Синтез пиреновых производных олигонуклеотидов Ол1Б1 и Ол2Б1
2.15. Синтез бензантраценового производного олигонуклеотида Ол282
2.16. Синтез периленового производного олигонуклеотида Ол2БЗ
2.17. Определение 8тах производных олигонуклеотидов
2.18. Гашение флуоресценции бензантраценовых производных

2.19. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды
2.20. Получение фрагментов одноцепочечной ДНК
2.21. Фотомодификация нуклеиновых кислот
2.22. Электрофоретический анализ продуктов модификации, авторадиография и денситометрия
2.23. Определение степени и позиционной направленности модификации ДНК-мишени
2.24. Определение каталитических свойств фотосенсибилизатора
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Многокомпонентные системы алкилирующих реагентов на основе олигонуклеотидов, полученных контролируемой фрагментацией полинуклеотидов
3.2. Комплементарно-адресованная модификация дц-ДНК плазмид. Влияние степени суперспирализации на эффективность адресованной модификации
3.2.1. Направленная модификация суперспирализованной ДНК плазмиды риС19-С2 алкилирующими производными олигонуклеотидов, полученных фрагментацией полинуклеотидов
3.2.2. Сайт-специфичная модификация суперспирализованных ДНК плазмид р160, р163 алкилирующими производными синтетических олигонуклеотидов
3.3. Бинарные системы олигонуклеотидных конъюгатов для высокоспецифичной фотомодификации нуклеиновых кислот
3.3.1. Принцип действия бинарных систем для направленной фотомодификации нуклеиновых кислот
3.3.2. Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотидной матрицы М1. Пиреновое производное олигонуклеотида в качестве сенсибилизатора
3.3.3. Позиционная направленность фотомодификации
3.3.4. Использование бензантрацена в качестве сенсибилизатора
3.3.5. Температурная зависимость эффективности фотомодификации
3.3.6. Каталитические свойства бинарной системы, определение числа оборотов фотосенсибилизатора
3.3.7. Использование перилена в качестве фотосенсибилизатора
3.3.8. Сенсибилизированная фотомодификация оц-ДНК бактериофагаМ13Ьгпг4
3.3.9. Сравнение селективности действия бинарных систем и реагентов для прямой модификации НК
3.3.9. Применение системы бинарных реагентов для выявления и характеризации белков, специфически взаимодействующих с регуляторным районом гена СУР
Выводы
Список использованной литературы
Примечания

Список используемых сокращений
ПААГ полиакриламидный гель
НК нуклеиновые кислоты
РНК рибонуклеиновая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
оц- одноцепочечная
дц- двухцепочечная
Ол1 олигонуклеотид 3 ' ТАСАААТ ТОАр
Ол2 олигонуклеотид 3' АОАААТТОАСр
ОлЗ олигонуклеотид 3! рТАСТТОААСА.
Ол4 олигонуклеотид 3 ’ рСТСТАТТАССТАбСТТСТ
Ол5 олигонуклеотид 3' СТвТАТТАСр
Олб олигонуклеотид 3 1 рСТАОЗТТОТ
М1 мишень олигонуклеотид 5 ' АТСТТТААСТ<ЗАТ(ЗААСТТСТ
М2 мишень смесь фрагментов одноцепочечной ДНК бактериофага М13ВМЯ4
М3 мишень олигонуклеотид 5 ' АСААС(ЗАСАТААТС(ЗАТССААСАС
М4 мишень олигонуклеотид 5 ' ССЗАСАТААТССАТСАААСА
М5 мишень олигонуклеотид 5 ' вСЗАСАСЗААТССЗАТСАААСА
Мб мишень олигонуклеотид 5 ' 6С5АСАОААТС(ЗАТССААСА
М7 мишень олигонуклеотид 5 ' СОАСАТААТССдАТААААСА
М8 мишень олигонуклеотид 5 ' СОАСАТААТбС
Б1 сенсибилизатор пиренил-1-метиламин
Б2 сенсибилизатор 5-фтор-7-метилбензо [Ь] антраценил-12-уксусной кислоты 2-аминоэтиламид
БЗ сенсибилизатор 3 -периленилметиламин
111 реагент и-азидотетрафторбензальгидразон-М-пропиониламина
Я2 реагент н-азидотетрафторбензамид
ьз линкер -ЫНДСНгД-М!-
Ь5 линкер -ТИДСНг-МН
Префикс “(1” при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклеотидных пар и мономерных звеньев дезокси- ряда для краткости написания опущен.
Материалы и методы

Глава 2. Материалы и методы
2.1. Ферменты
В работе были использованы ферменты: ДНК-топоизомераза I (фермент был любезно предоставлен К. А.Кафиани, ИМБ АН СССР); фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Kcoli, ДНК-лигаза фага Т4, полинуклеотидкиназа фага Т4, эндонуклеазы рестрикции EcoRI, Hindin, SalGI, Pstl, производства фирмы MBI "Fermentas" (Литва); эндонуклеазы рестрикции Rsal, HspAI (АОЗТ "Сибэнзим", Россия).
2.2. Реактивы
В работе использовали пиреновые соединения, синтезированные в НИБХ СО РАН Лукъянчук Н.П. (Добриков и др., 1997), N-оксисукцинимидный эфир 5-фтор-7-метилбензо[Ь]антраценил-12-уксусной кислоты был любезно предоставлен Лактионовым П.П., гидрохлорид перилен-3-метиламина, был синтезирован Тенетовой Е.Д. в НИБХ СО РАН (Добриков и др., 1998), [у-32Р]АТФ («АОЗТ Биосан», Россия), а также 1,3-диаминопропан, 1,5-диаминопентан (Ferak, Германия), ЭДТА, глицерин, трис(оксиметил)аминомеган, ксиленцианол ("Sigma Chemical Co.", США), тритон Х-100, бромистый этидий ("Merck", ФРГ), 2-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия, формамид, акриламид и Х,Х'-метиленбисакриламид ("Serva", ФРГ), бактотриптон, дрожжевой экстракт, бактоагар, хлористый кальций, персульфат аммония, литийалюмогидрид, саркозилат Na, фиколл 400, поливинилпирролидон, бычий сывороточный альбумин ("Fluka", Швейцария), агароза ("Chemapol", Чехословакия), N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин, глицин ("Reanal", Венгрия).
ИПТГ (изопропилтиогалактозид) и X-gal (5-бром-4-хлориндолил- -Д-галактозид были синтезированы к.х.н. Слынько Н.Н.
Остальные реактивы производства "Реахим", квалификации ХЧ и ОСЧ.
2.3. Плазмиды, бактериофаги и штаммы микроорганизмов
В работе использовали ДНК бактериофагов М13тр9 и М13тр18 и плазмиды pUCl8, pUC19 производства фирмы MBI “Fermentas” (Литва).
Плазмида р160, содержащая фрагмент гена к легкой цепи иммуноглобулина мыши и охарактеризованная в работе (Falkner et al., 1984), была любезно предоставлена Г.Г.
Цахау.