Казеиновая киназа типа 2: регуляция активности в ооцитах, поиск природных субстратов

• Автор: Маликова, Марина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура СК2.

2. Внутриклеточная локализация СК2 в различных клеточных структурах плазматической мембране, ядре, ядерном матриксе, ядрышке, нукпеосомах, митохондриях, эндоплазматическом рстикулуме, цитоскелете, центросомах

2.1. Плазматическая мембрана

2.2. Распределение СК2 между ядром и цитоплазмой

2.3. Ядро.

2.4. Ядерцый матрикс

2.5. Ядрышко

2.6. Нуклеосомы.

2.7. Митохондрии

2.8 Эндоплазматический ретикулум
2.9. Центросомы.
2 Цитоскелет
3. Потенциальные и установленные субстраты СК
3.1. СК2 фосфорилирует белки, вовлеченные в сигнальные пути и биосинтез белка
3.2. Фосфорилирование факторов транскрипции.
3.3. Субстраты СК2, вовлеченные в ДНКрепликацию, экспрессию генов и синтез белка.
4. Созревающие ооциты как модель для изучения регуляции активности и внутриклеточной локализации СК2 при изменении физиологического состояния эукариотических клеток
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы .
Буферные растворы.
1. Получение клеток и гомогенизация препаратов.
2. Получение безрибосомных экстрактов и хроматографическая очистка СК2
3. Стимуляция ооцитов прогестероном
4. Фракционирование клеточных гомогснатов
5. Определение активности СК
6. Дефосфорилирование казеина
7. Определение концентрации белка и ионной силы в пробах.
8. Клонирование, экспрессия и очистка подобного белка, кодируемого первой открытой рамкой трансляции мобильного ретроэлемента .
9. Фосфорилирование подобного белка
. Получение когранскрипционно меченной мРНК i vi
. Связывание нуклеопротеидных комплексов на нитроцеллюлозиых фильтрах.
. Электрофорез, радиоавтография и иммуноблоттинг СК2.
. Твердофазный иммуноферментный анализ I.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Универсальность хроматографических свойств СК2 из двух различных источников ооцитов . i и культуры клеток . .
2. Влияние фосфорилирования белка, кодируемого ОРТ1 на его связывание с РНК.
3. Активность и количество СК2 возрастали во фракции свободных РНКсвязывающих белков овулировавших i viv ооцитов . i.
4. Состав эндогспных субстратов СК2 изменяется при созревании ооцитов
. i.
5. СК2 активируется в процессе прогестерон индуцируемого созревания ооцитов .
i
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Возможно, наблюдаемые изменения активности СК2 являются следствием перераспределения фермента между различными клеточными структурами. Действительно, иммуноцитохимическими методами было показано, что действие некоторых гормонов вызывает обратимую транслокацию СК2 из цитоплазмы в ядро эукариотических клеток i . Повидимому, 2 распределяется по всему клеточному пространству неравномерно и в значительной степени зависит от локализации природных субстратов фермента, определяемой физиологическим состоянием клетки. Наблюдаемая во многих работах активация СК2 может быть объяснена переходом фермента в обычно исследуемую фракцию свободных цитозольных белков из мсмбраноцитоскслетсвязанной фракции. В данной работе исследуется перераспределение активности СК2 между различивши клеточными фракциями при созревании ооцитов . СК2 была получена в гомогенном состоянии из различных тканей позвоночных, насекомых, червей, грибов, растений и простейших Елизаров и др. Подавляющее большинство этих киназ являются олигомерами с молекулярной массой кДа и четырехсубъединичной структурой сшРг или агРг, где аа имеет молекулярную массу кДа и кДа V . Полная последовательность аминокислот определена для СК2 из дрозофилы x . X vi ii , нематоды ii i, . Кроме того, установлена первичная сгруктура каталитических субъединиц из . Полученные результаты говорят о высокой степени гомологии СК2 даже между эволюционно далекими видами организмов. Например, аминокислотная последовательность а субъединицы на гомологична у дрозофилы и дрожжей x . У человека и дрозофилы гомология а субъединицы СК2 достигает без учета характерной для млекопитающих последовательности из аминокислот у Сконца гомология субъединицы доходит до x . При изучении локализации и взаимозаменяемости генов, кодирующих субъединицы СК2, было показано, что ген, кодирующий а субъединицу СК2, у человека существует в двух локусах на различных хромосомах р. Каталитический центр СК2 полностью локализован на аа субъединицах причем отсутствие субъединицы не влияет существенным образом на активность фермента в отношении казеина , . СК2 найден основной кластер, формирующий, повидимому, а спираль, положительно заряженную и выступающую наружу i а. СК2 участвует в узнавании пептидного субстрата и является консервативным очень редко замещенным на почти у всех известных протеинкиназ i, . Однако, у а субъединицы СК2 найдено еще 5 основных аминокислот, расположенных на одинаковом расстоянии друг от друга , i 6,2,8,4, i . Возможно, эта характерная последовательность, как и положительная а спираль, необходимы для узнавания кислотных кластеров в субстратах СК2. В отличие от а субъединицы, хотя и слабо, но все же сходной с каталитическими субъединицами других протеинкииаз, 3 субъединица СК2 считается уникальной, так как ни с одной из известных регуляторных субъединиц не прослеживается заметной гомологии. Отличительной чертой структуры р субъединицы является концентрация основных остатков у Сконца при полном отсутствии кислых последний 3 на позиции от Сконца. В то же время у конца сосредоточены кислые аминокислоты, так, кластер из семи кислых остатков локализован в позициях x . Видимо, именно эта последовательность, взаимодействуя с основными остатками а субъединицы, стимулирует активность СК2, изменяя при этом и характер самофосфорилирования, и четвертичную структуру фермента i . Другая интересная деталь р субъединицы последовательность рядом с концевым , который ацетилирован. Эта последовательность является сайтом самофосфорилирования СК2 i viv i . Относительно недавно появились работы, поновому рассматривающие взаимосвясь а и а субъединиц i . После того, как были выделены два типа СК2 агр2 и аа р2, долгое время считалось, что а продукт ограниченного протеолиза асубъединицы Елизаров и др. При этом было не понятно, почему он наблюдается у млекопитающих и не наблюдается у дрозофилы. Сравнение первичных последовательностей а и а субъединиц СК2 из куриного эмбриона показало, что эти субъединицы являются продуктами разных генов. Оказалось, что а и а из одного организма идентичны на ,1 i .