Белковый состав нуклеоидов пластид высших растений и зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii

• Автор: Олескина, Юлия Петровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Геном хлоропластов и его функции

1.2. Особенности структуры хлоропластных генов

1.3. Регуляция экспрессии генома хлоропластов.

1.4. Митохондриальный геном.

1.5. Эндосимбиотическая гипотеза происхождения хлоропластов

и митохондрий.

1.6. Нукпеоиды бактерий и хлоропластов

1.6.1. Бактериальные нуклеоиды.

1.6.2. Нуклеоиды хлоропластов

1.7. Белки нуклеоидов хлоропластов
1.7.1. ДНКсвязывающие белки нуклеоидов хлоропластов.
1.7.1.1. Сайтспецифичные белки
1.7.1.2. Белки, неспецифичные к нуклеотидным последовательностям ДНК.
1.8. Нерибосомные функции рибосомных белков.
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования.
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Гомогенизация клеток
2.2.2. Выделение хлоропластов
2.2.2.1.Выделение хлоропластов из клеток высших
растений
2.2.2 2 Выделение хлоропластов из клеток СЫатуботопав
гетЬагсНИ.
2.2.3. Очистка хлоропластов с помощью градиентного центрифугирования
2.2.4. Лизис хлоропластов
2.2.5. Выделение нуклеоидов
2.2.5.1. Выделение нуклеоидов методами гельфильтрации
и ультрацентрифугирования.
2.2.5.2. Выделение нуклеоидов по модифицированному
методу Сато ., 7.
2.2.6. Фракционирование белков нуклеоидов повышающимися концентрациями I.
2.2.7. Экстракция белков основного характера
2.2.8. Электрофорез белков в ДЦС ПААГ
2.2.9. Окрашивание элекгрофореграмм Кумасси 0.
2.2 Окрашивание элекгрофореграмм азотнокислым серебром
2.2 Фотографирование гелевых пластин
2.2 Определение концентрации белка
2.2 Фракционирование основных белков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2.2 . Переваривание белков трипсином.
2.2 Определение первичной структуры белка.
2.2 Ковалентная фиксация ДНКбелковых контактов.
2.2 Исследование ДНК хлоропластов методом
электронной микроскопии
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выделение хлоропластов.
3.2. Выделение нуклеоидов.
3 3. Изучение белков нуклеоидов хлоропластов
3.4. Изучение белкового состава нуклеоидов этиопластов
3.5. Фракциониование белков нуклеоидов хлоропластов.
3.6. Изучение основных белков нуклеоидов хлоропластов,
3.7. Фиксация ДНКбелковых контактов в интактных хлоролластах
с помощью их ковалентной сшивки i vivv
3.8. Структура хлоропластного генома данные электронной микроскопии
4.ВЫВОДЫ. .
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА бычий сывороточный альбумин
I 4,6диамидино2фенилиндол
ДТТ дитиотреитол
ДНКаза I дезоксирибонуклеаза I
РНКаза рибонуклеаза I
МБАА М,Мметиленбисакриламид
рмэ 3меркаптоэтанол
ПААГ полиакриламидный гель
ТВЕбуфер мМ Трис, мМ борная кислота, 1мМ ЭДТА, 8,
ТЕбуфер мМ ТрисНС, 1 мМ ЭДТА, 7,
ТЕМЕД ,,, тетраметилэтилендиамин
Трис трисоксиметиламинометан
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
БСЕ РБФК большая субъединица рибулозобисфосфаткарбоксилазы
ФС I фотосистема I
ФС фотосистема II
ИП инвертированный повтор
кДа килодальтон
мтДНК митохондриальная ДНК
хпДНК хлоропластная ДНК
яДНК ядерная ДНК
ОРС открытая рамка считывания
п.н. пара нуклеотидов
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
большая субчастица рибосом хлоропластов
малая субчастица рибосом хлоропластов
полимераза кодируемая ядром РНКполимераза
РЕРполимераза кодируемая хлоропластным геномом РНКполимераза
белок ДНКсвязывающий белок оболочки хлоропластов
i i
ВВЕДЕНИЕ


Эти данные указывают на возможную полифункциональность белков нуклеоидов хлоропластов. К числу новых результатов, представленных в работе, следует отнести и данные электронной микроскопии о регулярно повторяющихся нуклеосомоподобных структурах в нуклеоидах хлоропластов, что позволяет провести параллель между хромосомной организацией про, эукариот и клеточных органелл. Установленные нами факты имеют не только очевидное теоретическое, но и практическое значение. Известно, что связанные с хромосомной ДНК белки несут важные регуляторные функции. Исследования хлоропластных аналогов хромосомных белков эукариот открывает перспективы повышения эффективности фотосинтеза как основной функции хлоропластов и тем самым, освоения новых возможностей для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур. Изучение генетической системы хлоропластов, в силу их большого значения для жизни и продуктивности растительной клетки, постоянно привлекает внимание исследователей. Хромосома хлоропластов высоко консервативна и мало изменяется в процессе эволюции от водорослей до высших растений. Так, хлоропластный геном одноклеточной жгутиковой водоросли i vii, наиболее рано дивергировавшей от линии высших растений, и геном хлоропластов высших растений имеют в общем одинаковую структуру и сходный размер , . В настоящее время происхождение хлоропластного генома от цианобактерий хорошо документировано, а эндосимбиотическая гипотеза подтверждена данными молекулярной биологии и методами компьютерного анализа полностью секвенированных геномов. Геном цианобактерий содержит более потенциальных генов белков, в то время как хлоропластный геном всего около генов белков. Таким образом, большинство генов эндосимбиотического предшественника хлоропластов были утерены или перенесены в ядро клеток. Сходство состава хлоролластных генов эволюционно далеких видов растений указывает на то, что большинство генов было перенесено от эндосимбиотического предшественника в ядро на очень ранних этапах эволюции растений. Предполагают, что перенос генов еще не закончился, однако встречается он довольно редко. После переноса хлоропластных генов в ядро, белки, кодируемые этими генами, получили дополнительно транзитный пептид, направляющий эти белки в хпоропласты. Каждая пластида содержит от нескольких десятков до нескольких сотен копий молекул ДНК, организованных в нуклеоиды. Эти структуры, которые также называют ядрами хлоропластов, можно легко видеть с помощью флуоресцентного микроскопа, после окраски I. В пропластидах обнаруживается один центрально расположенный нукпеоид. В молодых развивающихся активно делящихся пластидах число нуклеоидов увеличивается. На этой стадии развития пластид нуклеоиды ассоциированы с внутренней мембраной оболочки хлоропластов. ДНКсвязывающий белок с мол. Показано, что этот белок участвует в связывании нуклеоидов с оболочкой молодых пластид, а также в репликации ДНК. Хлоропластная ДНК представляет собой ковалентно замкнутую кольцевую молекулу с мол. Да т. Характерной особенностью структуры хпДНК большинства растений является наличие двух длинных размером около т. В эволюции пластидного генома эти сегменты имеют консервативную природу . Инвертированные повторы разделены большой и малой уникальными последовательностями. Геномы хлоропластов некоторых растений горох, конские бобы, , лишены инвертированных повторов. К настоящему времени секвенированы около хлоропластных геномов Юрина, Одинцова, . Среди них преобладают геномы хлоропластов протистов одноклеточных эукариот, включающих фотосинтезирующие жгутиковые и микроводоросли. Мало изучена структура ДНК хлоропластов высших растений. Среди них первым был секвенирован геном табака ii ii . Затем были секвенированы геномы сахарной свеклы vi ii . В таблице 1 приведены некоторые характеристики секвенированных геномов хлоропластов. Геном хлоропластов высших растений содержит в среднем генов, что составляет лишь небольшую часть генов, необходимых для функционирования этих органелл. Большая часть генов, кодирующих белки хлоропластов, локализована в ядре.