Анализ транспортера серотонина с помощью сайт-специфических антител

• Автор: Павлова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

1 Получение иммуногенных конъюгатов пептидов с бычь им сывороточным альбумином

5.2 Тестирование антител к фрагментам транспортера серо

тонина в иммунных сыворотках

5.3 Аффинная очистка антител к пептидным фрагментам

транспортера серотонина и их конъюгация с пероксида

зой хрена

5.4 Доказательство специфичности поликлональных антител

к Ыконцевым фрагментам СЕРТ иммуноблоттинг лизатов тромбоцитов, очищенных аффинно на антителах к Сконцевому фрагменту

5.5 Анализ иммунореактивности поликлональных антител к

Ыконцевым фрагментам СЕРТ и 0 в иммуноблоттинге экстрактов тромбоцитов человека

6 Анализ СЕРТ методом иммуноблоттинга в мозге челове

ка и крысы с помощью антител к Сконцу СЕРТ
V ОБСУЖДЕНИЕ
VI ВЫВОДЫ
VIII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ГТ глютатионтрансфераза
ИФА твердофазный иммуноферментный метод
МкАТ моноклональные антитела
ПкАт 0 поликлональные антитела к фрагменту транспортера серотонина 0 vviv
ПкАт поликлональные антитела к фрагменту транспортера серотонина v
ПААГ полиакриламидный гель
Р рекомбинантный белок в котором модифицированная глутатионтрансфераза ГТ соединена, в рамке, с фрагментом серотонинового транспортера
Р2 рекомбинантный белок в котором модифицированный тиоредоксинбНв ТГ присоединен, в рамке, к фрагменту серотонинового транспортера крысы
СЕРТ серотониновый транспортер
БЭЗПААГ электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия
ТГ тиоредоксинбНз
ТМД трансмембранный домен
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Таким образом, тромбоциты являются удобной экстрацеребральной моделью для изучения СЕРТ. Вместе с тем, систематических исследований по анализу СЕРТ в тромбоцитах методом иммуноблоттинга с использованием панели антител к различным участкам молекулы не проводилось, что затрудняет использование этой модели в фармакологических и нейробиологических исследованиях. СЕРТ б создание на их основе болсс эффективных и воспроизводимых тестсистем для иммунохимического анализа СЕРТ в том числе усовершенствованных вариантов иммуноблоттинга СЕРТ с использование этих методов для более детальной характеристики продуктов экспрессии гена СЕРТ в различных тканях и клетках. Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования анализ структурной организации молекулы СЕРТ в тканях крысы и человека с помощью сайтспецифических антител. СЕРТспецифических МкАТ в экстрактах мозга крысы и мозга человека. Научная новизна и научнопрактическая значимость исследования. Результаты нашей работы позволили высказать предположение, что молекула СЕРТ подвергается в тромбоцитах и клетках мозга эндопротеолизу с образованием нескольких полипептидов. Н.1. Возбужденный нейрон передаст информацию другим нейронам, генерируя импульсы потенциалы действия ПД. Эти потенциалы распространяются, как волна, вдоль длинного отростка аксона нервной клетки. Однако ПД не могут перескакивать с одной клетки на другую. Чаще всего связи между нейронами опосредуются химическими передатчиками специфическими веществами, называемыми нейромедиаторами, выделяющимися из окончаний отростков нейронов в области специализированных межклеточных контактов, называемыми синапсами. Когда ПД достигает аксонной терминал и окончания аксона, в ней открываются потенциал зависимые каналы для ионов кальция и в нервную терминаль поступают ионы кальция. Эти ионы воздействуют на сложный белковый комплекс, встроенный в мембрану внутриклеточных пузырьков везикул, содержащих медиатор, и везикулы синаптические пузырьки приходят в движение. Достигая пресинапгической мембраны, пузырек сливается с ней, и молекулы медиатора выходят из внутриклеточных пузырьков, где они хранятся, в синаптическую щель пространство шириною нм между мембранами пресинаптической и постсинаптической клеток. С поступлением электрического сигнала достаточной силы, возникает синхронный экзоцитоз координированное выделение молекул нейромедиатора. Молекулы медиатора диффундируют через синаптическую щель и связываются с рецепторами в последней. Такое связывание ведет к открыванию хемочувствительных ионных каналов и к генерированию ПД в постсинаптичсском нейроне. Подействовав на постсинаптическую мембрану, медиатор вновь переводит сигнал в электрическую форму. После этого происходит инактивация медиатора в синаптической щели подробнее см. Дубынин с соавт. Недоспалов, Николаев, . В жизненный цикл нейромедиаторов нервной системы входят следующие основные стадии 1 синтез, 2 загрузка в везикулы и транспорт в пресинаптическое окончание, 3 выброс содержимого везикул в синаптическую щель процесс экзоцитоза в момент прихода в пресинаптическое окончание возбуждения ПД, и 4 инактивация медиатора в синаптической щели Рис. Инактивация заключительный этап жизненного цикла медиатора. Смысл этой стадии состоит в прекращении его действия на рецептор прерывание передачи сигнала. Существует несколько механизмов для устранения действия медиатора диффузия, ферментативное расщепление и обратный захват. Установлено, что многие важные медиаторымоноамины и аминокислоты, такие как глютамат, серотонин, дофамин, норадреналин, глицин, ГАМК, инактивируются путем так называемого обратного захвата см. При этом медиатор присоединяется к специальному белкупереносчику на пресинаптической мембране, который возвращает его внутрь клетки. После возврата в пресинаптическое окончание, медиатор может быть разрушен, но может и повторно загружаться в пустые везикулы обзор i , . Загрузка нейромедиатора в везикулы осуществляется с помощью второго транспортного процесса, который следует отличать от механизма обратного захвата медиаторов из внеклеточного пространства.