Адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на ионогенных и неионогенных носителях

• Автор: Шкутина, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 145 с. : ил

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Структура и физикохимические свойства гидролитического

фермента глюкоамилазы

1.2. Особенности гидролиза полисахаридов глюкоамилазой

1.3. Способы иммобилизации глюкоамилазы

1.4. Влияние инактивационных процессов на стабильность свободного

и иммобилизованного фермента

Глава II. Характеристика объектов и методов исследования

2.1. Объекты исследования

2.2. Подготовка сорбентов к работе

2.3. Методика адсорбционной иммобилизации
2.4. Метод Лоури
2.5. Глюкозооксидазный метод
2.6. Подготовка образцов для исследования методом
ИК спектроскопии
Глава III. Иммобилизация глюкоамилазы на сорбентах различного типа
3.1. Иммобилизация глюкоамилазы на ионогенных носителях
3.2. Иммобилизация глюкоамилазы на неионогенном сорбенте
Стиросорб
3.3. Каталитические свойства иммобилизованного биокатализатора
3.4. Идентификация каталитически активных групп свободной и
иммобилизованной глюкоамилазы
Глава IV. Исследование характера взаимодейс твия глюкоамилазы с функциональными группами сорбентов методом ИК спектроскопии
4.1. Интерпретация спектрограмм свободной и иммобилизованной
глюкоамилазы
4.2. Расчет энергетических параметров водородной связи глюкоамилазаноситель
4.3. Исследование характера взаимодействия глюкоамилазы
со Стиросорбом
4.4. Влияние иммобилизации на изменение вторичной структуры белка
Глава V. Кислотная и термическая инактивация свободной и
иммобилизованной глюкоамилазы
5.1. Сравнительная характеристика стабильности иммобилизованной глюкоамилазы на разных носителях
5.2. Зависимость термостабильности свободного и иммобилизованного биокатализатора от концентрации ионов водорода
5.3. Определение кинетикотермодинамических параметров реакции гидролиза крахмала свободной и иммобилизованной глюкоамилазой
Заключение
Выводы
Список литературы


Экологически безопасные технологии МоскваТверь, , VIII Всероссийском симпозиуме по жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу Москва, , IX Международной конференции Физикохимические основы ионообменных процессовВоронеж, , на научных сессиях Воронежского госуниверситета г. Структура диссертации. Диссертация изложена на 5 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы 2 источника. Иллюстративный материал включает рисунка и таблиц. Глава I. Обзор литературы. I.I. Структура и физикохимические свойства гидролитического фермента глюкоамилазы. Фермент глюкоамилаза КФ З. З., а1,4глюкангидролаза катализирует гидролиз гликозидных связей в амилозе, амилопектине, гликогене, мальтоолигосахаридах. Фермент деполимеризует субстрат с нередуцирующего конца, т. Глюкоамилазы, получаемые из различных источников, обладают широкой субстратной специфичностью и могут расщеплять не только а1,4, но и а1,6, а1,3гликозидные связи, а также служат для определения связей в молекулах гликопротеидов, гликолигшдов. Глюкоамилаза присутствует во всех биологических объектах низших и высших растениях, в организме человека и животных, в плесневых грибах 13. К настоящему времени известны полных аминокислотных последовательностей глюкоамилазы различной природы, которые по степени гомологии можно разделить на 5 групп, одной из которых является группа i, содержащая 7 известных последовательностей i i, i , i i, , i i, i ii, i i. В работе описано определение нуклеотидной последовательности гена i i X0, а также проведено сравнение с нуклеотидными последовательностями генов глюкоамилазы близкородственных грибов 4. Амилолитические ферменты, синтезируемые различными продуцентами, отличаются друг от друга по некоторым физикохимическим свойствам. Фермент из i i характеризуется высоким температурным оптимумом, лучшей стабильностью и более широким интервалом , в котором он сохраняет активность 5,6. Глюкоамилаза из i i является гликопротеидом, молекулярная масса близка к 0 ООО Да, причем углеводная часть составляет от общего веса фермента 7. При секвенировании обнаружено, что фермент имеет четвертичную структуру, представленную димером из двух субъединиц. Анализ первичной структуры субъединиц показал, что в 1 аминокислоты, имеющие неполярные радикалы, составляют , а в 2 ,7 8. Анализируя данные, полученные методом гельхроматографии и методом графов, авторы подтверждают, что глюкоамилаза является олигомерным ферментом, состоящим из двух тождественных субъединиц, обладающих каталитической активностью 9,. Савельевым . ., Яковлевой М. Ф., Фирсовым Л. М. определен аминокислотный и углеводный состав глюкоамилазы 7. С помощью исследования продуктов Алешиным А. Н. проводились исследования глюкоамилазы методом рентгеноструктурного анализа . Установлено, что фермент имеет мультидоменную структуру и характеризуется наличием терминального домена, состоящего из 0 аминокислотных остатков, Огликозилированного участка, представленного аминокислотами, и Стерминального крахмалосвязывающего домена из 0 аминокислот. Каталитический домен имеет 2 гликозилированными цепями и полипептидом стабилизируется остатком маннозы с помощью водородной связи или ионизированными молекулами воды, что и определяет стабильность фермента и возможность образования надмолекулярных структур. Химический состав глюкоамилазы из i i. Неустросвым К. Н. с сотр. i i. Модификация Огликозильносвязанной углеводной компоненты проводилась аманнозидазой, отщепление гликозильносвязанной углеводной компоненты осуществлялась эндоРЫацстилглюкозоаминидазой . Сделан вывод, что дегликозилирование белка уменьшает его стабильность и устойчивость.