Структурно-функциональная характеристика белков мембраны включения Chlamydia trachomatis

• Автор: Басовский, Юрий Иванович
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика хламидий

1.1.1. Классификация хламидий, вызывающих патологии у

человека

1.1.2. Жизненный цикл хламидий

1.1.2.1. Инфицирование клетки. Ранние события часов

1.1.2.2. Развитие инфекции. Завершение внутриклеточного цикла 6часа

1.1.3. Организация промоторных областей хламидий. Сигма

факторы
1.2. Белки мембраны включения.
1.2.1. Гены белков мембраны включения в структуре генома
хламидий.
1.2.2. Экспрессионный профиль генов, кодирующих Iбелки
хламидий.
1.2.3. История открытия 1псбелков.
1.2.4. Классификация Iбелков по профилю гидрофобности.
1.2.5. Система секреции III типа у хламидий. Взаимосвязь с I
белками.
1.2.6. Функции Iбелков.
1.2.6.1. I А.
1.2.6.2. I.
1.2.6.3. СТ9.
1.3. Взаимодействие хламидий с системой везикулярного транспорта в
клетке. Экзоцитозный путь.
1.3.1. Динеинзависимый транспорт хламидийных включений в
область аппарата Гольджи по системе микротрубочек.
1.3.2. Экзоцитозный путь в клетке. Взаимодействие
хламидийного включения с азами.
1.3.3. Локализация Iбелков при экспрессии кодирующих их генов в эукариотических клетках.
Глава И. Материалы и методы исследования.
2.1. Материалы.
2.1.1. Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные векторы.
2.1.2. Реактивы.
2.1.3. Антитела и флуоресцентные красители.
2.1.4. Олигонуклеотиды.
2.2. Методы.
2.2.1. Выделение геномной ДНК С. i.
2.2.2. Выделение РНК из культуры клеток линии ,
зараженных С. i.
2.2.3. Реакция обратной транскрипции.
2.2.4. Полимеразная цепная реакция.
2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности
фрагментов генов, кодирующих Iбелки С. i.
2.2.6. Реакция рестрикции.
2.2.7. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.
2.2.8. Реакция лигирования.
2.2.9. Культивирование клеточных культур Е.
2.2 Трансформация клеток .i плазмидной ДИК.
2.2 Выделение плазмидной ДНК.
2.2 Поиск потенциальных промоторных областей 1псбслков.
2.2 Спектрофлюориметрический анализ активности
промоторных областей Iбелков в клетках .i.
2.2 Экспрессия генов i и i в клетках .i.
2.2 Массспектрометрический анализ рекомбинантных белков
iI и iI.
2.2 Выделение рекомбинантных белков I, I из клеток
.i.
2.2 Выделение цитоплазматической и мембранной фракций
трансфицированных клеток линии .
2.2. Получение антител к рекомбинантным белкам I, I
. i.
2.2. Иммуноблот.
2.2 Окрашивание антителами к I, I незараженной и
зараженной . i кул,туры клеток линии .
2.2 Трансфекция клеток линии .
2.2 Конфокальная микроскопия.
2.2 Флуоресцентное окрашивание плазматической мембраны,
ЭПР и аппарата Гольджи эукариотических клеток.
2.2 Подсчет параметров колокализации.
2.2 Дополнительное программное обеспечение.
Глава III. Результаты исследования.
3.1. Организация промоторных областей Iбелков С. i.
3.1.1. Предсказание промоторных областей для генов,
кодирующих Iбелки . i штамма . ii оперо II.
3.1.2. Клонирование промоторных областей Iбелков С.
i серовара .
3.1.3. Анализ активности и сравнение силы промоторных
областей Iбелков в клетках .i.
3.2. Определение локализации гидрофильных и гидрофобных доменов
I С, I С. i в культуре клеток линии .
3.2.1. Клонирование гидрофильныхШ и гидрофобныхГоЬ
доменов I, I . i.
3.2.2. Определение локализации рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов Iбелков С. i при экспрессии их генов в культуре клеток линии i.
3.2.3. Выявление колокализации рекомбинантных гидрофобных доменов I, I . i с эукариотическими органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии .
3.3. Получение антител к I, I . i.
Глава IV. Обсуждение результатов исследования.
Заключение.
Выводы.
Список цитируемой литератугры.
Список используемых сокращений
i, зеленый флюоресцирующий белок Iбелки ii i, белки мембраны включения МОМР i, основной наружный мембранный белок
МТОС i ii , центр организации микротрубочек iiv , растворимый чувствительный рецептор прикрепления
iii i, перемещаемый актин
реорганизующий фосфонротеин
i , трансГольджи сеть
ii, пшеничный зародышевый агглютинин
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК комплиментарная ДНК
мРНК матричная РНК
ОРС открытая рамка считывания
пн пара нуклеотидов
РНК рибонуклеиновая кислота
РТ ретикулярные тельца
ССТТ система секреции III третьего типа
ЭПР эндоплазматический ретикулум
ЭТ элементарные тельца
Введение.
Актуальность


Вышеприведенные факты делают обоснованным предположение о ключевой роли iбелков в жизненном цикле развития хламидпй и взаимодействии с эукариотической клеткой, что и привлекает к ним внимание исследователей. Тем не менее, механизмы патогенеза хламидийной инфекции, а так же механизмы взаимодействия с эукариотической клеткой остаются малопонятными. На сегодняшний день известны только три хламидийных белка, секретируемыс в цитоплазму клеткихозяина в процессе инфекции специфическая иротеиназа . III типа у хламидий белок, вызывающий реорганизацию актина i . ССА7, функции которого неизвестны i . Да i . Также мало исследованы механизмы, благодаря которым хламидия избегает действия защитных систем клетки, главным образом ее зндосомнолизосомного аппарата. Известно лишь, что маркеров, характерных для поздних эндосом, в мембране включения не обнаружено i . Для транспортировки внутри инфицированной клетки хламидия использует ее транспортные системы, в том числе с участием моторного белка динеина . Таким образом, учитывая огромное клиническое значение хламидий, а также их уникальность среди всех внутриклеточных паразитов, изучение их взаимодействия с эукариотическими клетками является актуальной задачей как с научной, так и с медицинской точек зрения. Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе реализован один из походов к выявлению структурнофункциональной организации генов и белков мембраны включения семейства I С. В результате показана принадлежность генов i и псС С. Для промоторов данных генов предсказаны точки начала транскрипции, а так же и консервативные области. Проведено сравнение их активности в гетерологичной системе Е. В качестве объекта для исследования структурнофункциональной характеристики белков мембраны включения нами были выбраны белки мембраны включения I, I, I, I, относящиеся к белкам ранней фазы инфекции, гены которых начинают экспрессироваться в течениие первых двух часов после заражения клетки. Основываясь на данных структурного анализа Iбелков и предполагаемого расположения в мембране, полученных с использованием программы I, нами была определена локализация их рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов, слитых с репортерной молекулой в культуре клеток линии . Полученные данные показали, что локализация полноразмерных I, I полностью определяется их гидрофобными доменами. При этом, используя метод сайтиаправленного мутагенеза, лишь частично удалось добиться изменения локализации I в клетке. Локализация I оставалась неизменной. I находился в одной рамке считывания с генами гидрофильных доменов I, I, I. После трансфекции культур клеток линии два из трех химерных белков распределялись сходно с полноразмерным I. Для определения возможной сортирующей последовательности, локализованной в гидрофобном домене I и ответственной за специфичную локализацию белка в эукариотической клетке, данный домен был разбит на несколько участков, формирующих определенные вторичные структуры в белке. Распределение полученных составных белков в эукариотической клетке показало отсутствие их тропности к определенным клеточным органеллам, характерной для полноразмерного белка I. Таким образом, сопоставляя полученные данные с результатами исследования мутантных форм Iбелков можно прийти к выводу, что по крайней мере для I не характерно наличие какихлибо сортирующих последовательностей, определяющих специфичную локализацию в клетке. Для специфичного распределения белка необходим полноразмерный гидрофобный домен, обладающий определенной структурой. Так же были получены поликлональные мышиные антитела для белков ранней фазы инфекции I, I биологическая функция которых не известна. Полученные антитела могут использоваться в дальнейшем как дополнительный инструмент в исследованиях функциональной роли Iбелков в жизненном цикле С. Полученные данные но структурнофункциональной организации Iбелков могут быть в дальнейшем использованы для определения их роли в патогенезе хламидийиой инфекции, а также для поиска белковпартнеров. Расшифровка молекулярных механизмов взаимодействия с эукариотической клеткой может стать основой для разработки новых лекарственных препаратов для терапии хламидиозов.