Дисфункция мозговой изоформы креатинфосфокиназы при психической патологии : Болезнь Альцгеймера и шизофрения

• Автор: Савушкина, Ольга Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

Список использованных сокращений.

I. ВВЕДЕНИЕ

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Функционирование креатинкреатинфосфагной

системы в мозге

Свойства креатинфосфокиназы

Гетерогенность креатинфосфокиназы

Микрогетерогенность креатинфосфокиназы.

Физикохимические свойства креатинфосфокиназы

Клеточная и региональная локализация

креатинфосфокиназы ВВ в мозге
Изучение активного центра креатинфосфокиназы.
Фосфорилирование как способ регуляции
активности.
Креатинкреатинфосфатная система в мозге при нервной
и психической патологии
Возможные причины снижения активности
креатинфосфокиназы.
Возможная стратегия в терапии нервных и психических
заболеваний
Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Биохимические методы.
Получение экстрактов водорастворимых белков мозга
Получение экстрактов для выделения моноклональных
антител
Определение концентрации белка.
Определение активности креатинфосфокиназы
Хроматографические методы
Ионообменная хроматография.
Гельфильтрация
Электрофоретические методы.
Электрофорез в полиакриламидном геле с
додецилсульфатом натрия
Окраска полиакриамидных гелей
Двумерный электрофорез.
Иммунохимические методы
Иммуноферментный метод анализа.
Приготовление коньюгата моноклональных
антител с пероксидазой хрена.
Вестерниммуноблоттинг.
Вестрниммуноблоттинг с хемилюминесцентным
усилением сигнала
Иммунологические методы .
Получе1ше антисывороток и их тестирование
Получение моноклональных антител
Статистическая оценка данных
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.
Выделение мозговой, мышечной и
митохондриальной креатинфосфокиназы.
Получение и характеристика антисывороток и моноклональных антител к мозговой изоформе
креатинфосфокиназы
Определение содержания мозговой изоформы креатинфосфокиназы в экстрактах водорастворимых белков лобной и зрительной коры лиц контрольной группы,
больных шизофренией и болезнью Альцгеймера
Особенности регионального распределения мозговой изоформы креатинфосфокиназы при шизофрении и
болезни Альцгеймера.
Оценка снижения иммунореактивности мозговой изоформы креатинфосфокиназы в различных областях
мозга при шизофрении
Выделение мозговой изоформы креатинфосфокиназы из мозга человека без психической патологии, больных шизофренией и болезнью Альцгеймера
V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
VI. ВЫВОДЫ.
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Список использованных сокращений
БСА бычий сывороточный альбумин
ИФА иммуноферментый анализ
ИЭТ изоэлектрическая точка
Кр креатин
Крф креатинфосфат
КФК креатинфосфокиназа
КФК вв мозговая изоформа креатинфосфокиназы
КФК мм мышечная изоформа креатинфосфокиназы
мит КФК митохондриальная креатинфосфокиназа
МАт моноклональные антитела
2МЭ 2меркаптоэтанол
ПААТДСИа полиакршамидньй гель с додешлсульфатом натрия
ПСА персульфат аммония
ТЕМЕД тетраметилэтилендиамид
Трис трисгидроксиметилметиламин
ФМСФ фенилметилсульфонил фторид
ЭДТА этилендиаминтефауксусная кислота
ЯМР ядерный магнитный резонанс
БРЬС высоко эффективная жидкостная хроматофафия
ДО иммуноглобулин в
Ма мозговая митохондриальная креатинфосфокиназа
Мь мышечная митохондриальная креатинфосфокиназа
Г. ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность


При болезни Альцгеймера и шизофрении в экстрактах белков лобной коры выявлено снижение активности и содержания мозговой изоформы креатинкиназы КФК ВВ 1,2, , , , , . В связи с этими данными, исследование креатинкреатинфосфатной системы в мозге при различных психических заболеваниях представляется актуальным. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление особенностей распределения мозговой изоформы креатинфосфокиназы КФК ВВ при психических заболеваниях болезни Альцгеймера и шизофрении. Работа состояла из трех частей, каждая из которых имела свои задачи. Выделение КФК ВВ из мозга лиц, не страдавших психическими заболеваниями. Получение моноспецифической ангисыворотки к КФК ВВ. Разработка метода оценки уровня иммунореактивности КФК ВВ в экстрактах мозга с использованием вестерниммуноблоттинга. Изучение регионального распределения КФК ВВ в мозге человека в норме и при психической патологии болезни Альцгеймера и шизофрении. Получение моноклональных антител к КФК ВВ. Разработка метода определения содержания КФК ВВ в экстрактах белков мозга с использованием вестерниммуноблоттинга с хемилюминесцентным усилением сигнала. Апробация этого метода при определении КФК ВВ в различных структурах мозга человека в норме и при шизофрении. Выделение КФК ВВ из мозга человека, не страдавшего психическими заболеваниями, мозга больных шизофренией и болезнью Альцгеймера. Сравнительное изучение молекулярной массы, изоэлектрической точки, микрогетерогенности Всубъединицы КФК. Основные положения работы. Выполненная экспериментальная работа позволила сформулировать следующие ее основные положения. При болезни Альцгеймера и шизофрении в экстрактах белков всех исследованных структур мозга обнаружено достоверное снижение содержания КФК ВВ по сравнению с соответствующими структурами мозга лиц контрольной группы. При болезни Альцгеймера и шизофрении обнаружены различия в снижении содержания КФК ВВ по интенсивности и локализации. Так, при болезни Альцгеймера более глубокое снижение содержания КФК ВВ по сравнению с шизофренией наблюдается в экстрактах водорастворимых белков лобной, зрительной, слуховой, соматосенсорной, лимбической коры, гиппокампа и скорлупы. При болезни Альцгеймера снижение содержания КФК ВВ в 4 структурах зрительной, слуховой, лимбической коре и скорлупе более выражено, чем в лобной коре. При шизофрении снижение содержания КФК ВВ более глубокое, чем в лобной коре наблюдается в 8 структурах зрительной, слуховой, лимбической коре, гиппокампе, хвостатом ядре, скорлупе, коре мозжечка и продолговатом мозге. Методом двумерного электрофореза выявлена микрогетерогенность субъединицы КФК ВВ, выделенной из мозга лиц контрольной группы, больных шизофренией и болезнью Альцгеймера. Обнаружено изменение количества и соотношения микроизоформ Всубъединицы КФК при шизофрении и болезни Альцгеймера по сравнению с контролем. Разработан количественный метод определения КФК ВВ в экстрактах белков мозга. Научная новизна работы. В работе впервые проведено сравнительное изучение распределения КФК ВВ в различных структурах мозга при болезни Альцгеймера и шизофрении. Во всех исследованных структурах мозга лобная, зрительная, слуховая, соматосенсорная, лимбическая кора, гиппокамп, хвостатое ядро, скорлупа, кора мозжечка и продолговатый мозг обнаружено достоверное снижение содержания КФК ВВ по сравнению с контролем. Однако, снижение содержания КФК ВВ при этих заболеваниях различалось по интенсивности и локализации. Так, при болезни Альцгеймера оно было более глубокое, чем при шизофрении в лобной, зрительной, слуховой, соматосенсорной, лимбической коре, гиппокампе и скорлупе. При этом же заболевании уровень КФК ВВ в четырех структурах зрительной, слуховой, лимбической коре и скорлупе был значительно ниже, чем в лобной коре, а в остальных пяти исследованных структурах он был такой же, как в лобной коре. При шизофрении содержание КФК ВВ в лобной и соматосенсорной коре было на одном уровне, а в остальных структурах оно было ниже, чем в лобной. Получены данные о микрогетерогенности Всубъединицы КФК, выделенной из мозга лиц контрольной группы, мозга больных шизофренией и болезнью Альцгеймера.