Бактериофаг Т4: молекулярное клонирование генов и суперпродукция ферментов метаболизма ДНК

• Автор: Таняшин, Валерий Иванович
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.03, 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 493 c. : ил

Гены системы модификациирестрикции I клонированы в составе плазмид, обеспечивающих высокий уровень синтеза обоих ферментов Косых и др. Косых и др. В настоящее время авторы планируют исследование первичной структуры генов метилазы и рестриктазы, а также юс аминокислотной последовательности. Гены системы модификациирестрикции v также клонированы в составе гибридных плазмид, содержащих регуляторную область бактериофага Л, и получены штаммысуперпродуценты рестриктазы v. Учитывая значительное сходство участков узнавания эндонуклеаз рестрикции I ГААТТЦ И V ГАТАГЦ и способность ферментов гидролизовать ДНК с различными модифицированными основаниями, было бы очень заманчиво провести изучение рестриктазы v в плане взаимодействия белокДНК на уровне, на котором в настоящее время проводятся исследования ферментов системы модификациирестрикции
1. Известно, что рестриктазы П типа при оптимальных условиях узнают только специфическую последовательность нуклеотидов. Изменение условий гидролиза приводит к существенному ослаблению специфичности. И в этом отношении I наиболее хорошо изученная рестриктаза. Понижение ионной силы, сдвиг в щелочную область и присутствие в реакционной омеси ионов Мп приводит к тому, что разрыв происходит в точках расположения последовательностей дХААТТУ i . Такая активность была обозначена как I Одаако даже в условиях реакции, характерных для I, разрыв прежде всего происходит В специфическом I
гексануклеотиде и в дальнейшем различные сайты расщепляются с разной скоростью, причем очень важным фактором является то, остаток какого нуклеотида располагается на месте X. Лучше всего гидролиз идет, если ХГ,хуже, если ХА, еще хуже, если ХТ и хуже всего если ХЦ. Совсем недавно фон Хилпель с сотр. ДНК фага 0X4, которая не содержит участков узнавания эндонуклеазы I . I В УСЛОВИЯХ I. Участки узнавания локализовали с помощью рестрикционного картирования и соответствующие участки вирусной ДНК проверяли на наличие последовательностей более или менее гомологичных каноническому I сайту . Такой анализ показал, что наиболее чувствительные к действию I последовательности ДНК дГГАТТТ, дАААТТТ, дГААТТТ и дГААТТА Однако не все последовательности дАААТТТ в репликативной форме ДНК фага 0X4 гидролизовались одинаково легко . Кроме того, было показано, что последовательность дГГАТТТ, легко гидролизовавшаяся в молекуле ДНК фага 0X4, оказалась устойчивой в случае ДНК вируса V , , . Снижение специфичности обычно связывается с различными эффектами измененных условий реакции на природу комплексов между субстратом и ферлентом. Такому объяснению соответствует присутствие измененной активности даже в очень хорошо очищенных препаратах эндонуклеаз i . Следует подчеркнуть, что в отличие от данных большинства других работ, Тихоненко с соавторами i . I и I активности могут быть связаны с разными ферментами. Так, по их наблюдениям I активности очищенных препаратов ферментов поразному инактивируются в процессе длительного хранения 2 эндонуклеаза I , изолированная в присутствии неионных детергентов, содержит более выраженную I активность, чем препарат, приготовленный в их отсутствии 3 I активность снимается парахлормеркурийбензоатом, в то время как последний не влияет на активность I . Хотя нагл представляется, что вышеуказанные интересные данные и не доказывают окончательно, что I и I активности связаны с различными ферментами, они дают основание планировать дальнейшие работы в этом направлении. Было бы чрезвычайно интересно отработать такие, например, условия, которые бы обеспечили в реакционной смеси преимущественное нахождение фермента в виде димера или тетрамера. Не исключено, что осуществляемый в этих условиях разрыв ДНК был бы в одном случае преимущественно ПО типу I, в другом ПО типу I. Все опубликованные работы, касающиеся ослабления специфичности, отмечают, что такое изменение имеет место в присутствии ионов Мпили органических растворителей глицерина, диметилсульфоксида, диметилацетамида и диметилформамида. Отмечается, что при разных условиях, вызывающих изменение специфичности, атакуются одни и те же последовательности i .