Изучение реакций преобразования энергии в NADH: убихинон-оксидоредуктазах митохондрий и прокариот

• Автор: Ушакова, Александра Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Организация дыхательной цепи

Строение Комплекса 1

Комплекс I митохондрий эукариот

Комплекс I прокариот

Пространственная организация Комплекса 1

Каталитические активности Комплекса 1

Нечувствительные к ротенону активности Комплекса 1
АЭН феррициани дреду ктазная реакция
ЫАГНгексааминорутенийредукгазиая реакция.
Генерация супероксиданиона Комплексом 1
Трансгидрогеназная реакция
Чувствительные к ротенону активности Комплекса I
Энергонезависимые реакции Комплекса 1
Разобщенная ЫАОНоксидазная реакция.
ЫАЕНубихинонредуктазная реакция
Энергозависимые реакции Комплекса 1
АТРподдерживаемая реакция обратного переноса электронов
Сукцинатподдерживаемая реакция обратного переноса электронов 2
Гисгерезисное поведение Комплекса I
Очищенные препараты Комплекса 1
Ингибиторы Комплекса I.
Ингибиторы, действующие по нуклеотидсвязываюицим центрам
Комплекса I.
Ингибиторы, действующие по хинонсвязывающему центру Комплекса I .
Механизм электрохимического сопряжения в Комплексе 1
Определение стехиометрического коэфициента п Г2 для Комплекса I
митохондрий эукариот и бактерий.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Препаративные методы
Получение митохондрий сердца быка
Получение субмитохондриальных частиц из митохондрий сердца быка
Получение активированных и деактивированных субмитохондриальных
частиц.
Выращивание бактерий ii.
Получение препарата суббактериальных частиц iii.
Аналитические методы
Определение белка
Измерение активности ферментов дыхательной цепи
Измерение оксидазной активности
а Полярографическое определение оксидазной активности
б Спектрофотометрическое определение оксидазной
активности.
Измерение сукцинатоксидазной активности
Измерение реакций окисления различными искусственными акцепторами электронов
а Измеренине Iiредуктазной активности
б Измерение ИЛОГЕферрицианидредуктазной активности.
в Измерение ЫАОНгексааминорутенийредуктазной активности.
Измерение скорости обратного переноса электронов
а Аэробное восстановление сукцинатом.
б Аэробное восстановление феррицианида сукцинатом.
Измерение активности протонтранслоцирующей трансгидрогеназы в составе СМЧ.
а Измерение трансгидрогсназной активности СМЧ
б Измерение АРАОНэКАОРтрансгидрогеназной активности СМЧ
Регистрация протонтранслоцируюицей активности и окисления ЫЛИН
Регистрация мембранного потенциала СМЧ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Амфифильные ингибиторы Комплекса 1.
Влияние Тритона Х0 на КАОНакцепторредуктазные активности,
катализируемые Комплексом I в составе СМЧ.
Влияние Тритона Х0 иа ингибирование Комплекса I ротеноном
Влияние Тритона Х0 на процессы активациидеактивации Комплекса I
Влияние Тритона Х0 на обратный перенос электронов
Влияние лаурил сульфата натрия на различные активности СМЧ
Влияние Тритона Х0 и лаурил сульфата натрия на активности
суббактериальных частиц Р. сепгсат
Траислокация протонов КОН в составе СБЧ бактерии Р. сепмгсат
Активация протонтранслоцирующей активности Комплекса I СБЧ
Р. сепгсапз.
Определение коэфициента п Н2 для ЫАОНубихинонредуктазной реакции СБЧ.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Амфифильные ингибиторы Комплекса 1.
Транслокация протонов бактериальным Комплексом 1.
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Аэробное восстановление феррицианида сукцинатом. Измерение активности протонтранслоцирующей трансгидрогеназы в составе СМЧ. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Амфифильные ингибиторы Комплекса 1. Комплексом I в составе СМЧ. Траислокация протонов КОН в составе СБЧ бактерии Р. Р. сепгсапз. Определение коэфициента п Н2 для ЫАОНубихинонредуктазной реакции СБЧ. Амфифильные ингибиторы Комплекса 1. Транслокация протонов бактериальным Комплексом 1. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. Протонтранслоцирующие ЫАОНхиноноксидоредукгазы и бактериальные 11 в составе сопрягающих мембран катализируют обратимое окисление ЫАОН убихиноном, сопряженное с векторным переносом протонов через мембрану. Комплекс I митохондрий сердца быка очень сложно устроен и состоит не менее чем из различных субъединиц с общей молекулярной массой около кДа. Переносчиками электронов в молекуле Комплекса I служат РМЫ, 58 РеБ кластеров и связанный убихинон. Бактериальные 41 состоят всего из субъединиц, гомологичных субъединицам эукариотического фермента, и содержат тот же набор кофакторов, что и Комплекс I митохондрий эукариот. Бактериальные 41 способны выполнять функции эукариотического Комплекса 1 и чувствительны к действию его специфических ингибиторов. Несмотря на значительные успехи в изучении субъсдиничного состава, механизмы переноса электронов и протонов, катализируемые Комплексом I или ЫЭН1, неизвестны. Установление этих механизмов остается одной из центральных нерешенных проблем фундаментальной биоэнергетики. При изучении сложно устроенных ферментов и, в частности. Комплекса I, большую пользу приносит ингибиторный анализ. Важнейшим параметром ИАОНубихинонредуктазной реакции является величина стехиометрическою коэфициента п Н2, поскольку любая модель электрогенеза ферментом должна основываться на значении этого коэфициента. Установлено, что для Комплекса I митохондрий сердца быка, величина стехиометрического коэфициента составляет 4 Н2. Упрощенная структура 41 может обусловить меньшую или большую термодинамическую эффективность первого пункта сопряжения. Величина стехиометрического коэфициента п Н2 для бактериального Комплекса I па сегодняшний день точно не определена. Большинство работ по определению протонтранслоцируютцей активности бактериальных 41 проводились на препарате ингактных клеток, которые очень сложны как объек1 исследования. Содержание настоящей работы состоит из обзора литературных данных, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения полученных результатов и выводов, следующих из них. Обеспечение аэробной клетки энергией происходит за счет работы ферментов дыхательной цепи. Дыхательная цепь состоит из четырех главных компонентов ЫАОНубихиноноксидорсдукгазы Комплекс I. Комплекс И, у бихинол щитохром соксидоредл ктазы Комплекс III и цитохром соксидазы Комплекс IV. У млекопитающих все эти ферменты расположены во внутренней мембране митохондрий и осуществляют процесс окисления I I и сукцината кислородом схему устройства дыхательной цепи и катализируемых ею реакций см. У большинства прокариот аналогичные компоненты дыхательной цепи расположены в плазматической мембране клетки, а акцептором электронов кроме кислорода могут служить другие соединения например, нитрат. Работа дыхательной цепи сопряжена с запасанием энергии в виде трансмембраниой разницы электрохимических поленциаюв ионов Н АрН. Генерация ДрН осуществляется тремя дыхательными Комплексами I, III и IV. АТРазой Комплекс V для синтеза АГР из и неорганического фосфата. МАВНубихиноноксидоредукгаза Комплекс I, КФ 1. II, выполняющего роль главного восстановительного эквивалента клетки. Комплекс 1 митохондрий млекопитающих представляет собой офомную молекулу, состоящую, по меньшей мере, из различных полипептидов с общей молекулярной массой около кДа , . Семь субъединиц Комплекса I кодируются геномом митохондрий, остальные ядерным геномом . . .