Малая субъединица гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции нового типа BspD61

• Автор: Юнусова, Альфия Кяшафовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 115 с. : ил.

1.1. Общее представление о системах рестрикциимодификации

1.2. Системы рестрикциимодификации типа I .

Г. 3. Системы рестрикциимодификации типа III

1.4. Системы модификациирестрикции типа IV

1.5. Системы рестрикциимодификации типа II.

1.5.1. Общее представление о системах

рестрикциимодификации типа II.

1.5.2. Эндонуклеазы рестрикции типа II.

1.5.3. Стратегии взаимодействия эндонуклеаз рестрикции типа II с ДНК

1.5.4. ДНКметилтрансферазы систем рестрикции

модификации типа II

1.5.5. Никующие эндонуклеазы.
1.5.6. Гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции
тип ИТ
1.5.7. Пространственная структура никующей эндонуклеазы Ы.ВзрБ.
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
.1. Материалы.
.2. Методы
Рестрикция 4
Лигирование 4
Включение метки в 5концы ДНК .4
Электрофорез в агарозном геле .
Электрофорез белков в ПААГ
Торможение в геле .
ПЦРамплификация.
Очистка фрагментов ДНК.
Получение компетентных клеток .i и
трансформация клеток.
Выделение плазмидной ДНК для последующего
автоматического секвенирования.
Индукция экспрессии генов в клетках . i.
Определение титра фага5
Проверка способности фага АСЕ6 активировать
транскрипцию с промотора фага Т7.
Получение штаммапродуцеита малой субъединицы .
Выделение малой субъединицы .
Выделение никующей эндонуклеазы .I.
Определение активности никазы .
Секвенирование ДНК.
Точки расщепления на ДНК эндонуклеазой рестрикции .6.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ.
III. 1. Клонирование открытой рамки считывания,
прилегающей к гену никазы
1.2. Выделение продукта открытой рамки считывания.
1.3. Анализ активности продукта открытой рамки считывания
III. 4. Характеристика малой субъединицы.
III. 5. Кристаллизация малой субъединицы.
1.6. Структура малой субъединицы .
1.7. Сайтнаправленный мутагенез никазы
IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
ВВЕДЕНИЕ


Получение компетентных клеток . Индукция экспрессии генов в клетках . Т7. Получение штаммапродуцеита малой субъединицы . Выделение малой субъединицы . Выделение никующей эндонуклеазы . Определение активности никазы . Секвенирование ДНК. Точки расщепления на ДНК эндонуклеазой рестрикции . III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ. III. Выделение продукта открытой рамки считывания. III. Характеристика малой субъединицы. III. Кристаллизация малой субъединицы. Структура малой субъединицы . IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ВЫВОДЫ. Эндонуклеазы рестрикции узнают в ДНК короткую н. ОепВапк. Это чрезвычайно быстро эволюционирующее семейство, что проявляется в необычном разнообразии стратегий, используемых эндонуклеазами рестрикции для расщепления ДНК по двум цепям. Так, эндонуклеазы рестрикции, узнающие симметричную палиндромную последовательность, взаимодействуют с этой последовательностью в виде гомодимера. ДНК происходит только после димеризации мономеров, связанных с двумя разными копиями сайтов. В последние годы были выявлены два новых типа эндонуклеаз рестрикции двухсайтовые и гетеродимерные. Двухсайтовые эндонуклеазы рестрикции взаимодействуют с ДНК в виде мономера, который содержит два каталитических центра. Один каталитический центр расщепляет верхнюю цепь ДНК, другой нижнюю. Гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции состоят из двух различных субъединиц, каждая из которых содержит по одному каталитическому центру и каждая из которых расщепляет свою цепь ДНК. Двухсайтовые и гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции явились основой для конструирования нового типа ферментов никующих эндонуклеаз. ДНК в строго фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Но в отличие от эндонукулеаз рестрикции никующие эндонуклеазы расщепляют только одну из цепей ДНК. Никующие эндонуклеазы стали важным инструментом молекулярной биологии. На их основе уже создан ряд новых биотехнологических методов. Предполагается, что некоторые проблемы нанотехнологий на основе ДНК могут быть решены с применением этих ферментов. Никующие эндонуклеазы были открыты вначале как самостоятельные ферменты. Предполагалось, что они являются природно мутировавшими эндонуклеазами рестрикции, которые утратили способность к димеризации и, как следствие, способность расщеплять ДНК по двум цепям. В представленной работе впервые показано, что никующие эндонуклеазы являются одной из субъединиц большой гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции. Настоящая работа посвяшена изучению свойств и определению пространственной структуры малой субъединицы гетеродимериой эндонуклеазы рестрикции Вврбв. I.1. При исследовании закономерности размножения фага А в клетках . ДНК от чужой фаговой . За ограничение англ. ДНК и гидролизующая ДНК по обеим цепям. Защиту хозяйской ДНК от автогидролиза обеспечивает ДНКметилтрансфераза, которая узнает ту же последовательность, что эндонуклеаза рестрикции, и метилирует по одному основанию аденин или цитозин в каждой цепи узнаваемой последовательности. Совокупность двух активностей эндонуклеазной и ДНКметилтрансферазкой получила название система рестрикциимодификации. Таким образом, системы рестрикциимодификации являются последним барьером на пути проникновения чужеродной ДНК в клетку и рассматриваются как примитивная иммунная система бактериальной клетки. Системы рестрикциимодификации очень распространены у бактерий. Среди более 0 геномов бактерий и архей, секвенированных на сегодняшний день, содержат системы рестрикциимодификации, а около из них имеют более одной системы. Больше всего систем рестрикциимодификации обнаружено у i i , этот штамм содержит системы . Впервые ферменты рестрикциимодификации были выделены и охарактеризованы из i i и . Эти ферменты расщепляли ДНК без образования гомогенных фрагментов. В г. Смит с соавторами из i i выделили эндонуклеазу рестрикции, которая расщепляла ДНК с образованием гомогенных фрагментов i . Эндонуклеазы рестрикции с такими свойствами стали основой методов генной инженерии, что привело к революции в молекулярной биологии. Последовавший после г.