Роль положительно заряженных остатков аминокислот во взаимодействии аминоацил-тРНК-синтетаз с субстратами

• Автор: Смоленцева, Ирина Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 148 c. : ил

Введение.

Глава I Обзор литературы

Роль электростатических сил в белковонуклеиновых взаимодействиях

1.1. Количественная оценка электростатических взаимо

действий в системе белок нуклеиновая кислота . .

1.2. Химическая модификация метод идентификации функциональных групп белков

1.2.1. Типы реакций и реагенты, используемые для модификации положительно заряженных остатков аминокислот

1.2.2. Механизм и специфичность действия оСдикарбонильных соединений

1.3. Положительно заряженные остатки аминокислот в анионевязывающих центрах белков

1.4. Роль электростатических контактов во взаимодействии аминоацилтРНКсинтетаз с субстратами. . .

Глава 2. Экспериментальная часть. Материалы и методы .

Глава 3. Исследование роли остатков аргинина во взаимо
действии фенилаланилтРНКсинтетазы из Е.С1 М1Е
с субстратами.
3.1. Модификация остатков аргинина с помощью 2,4пен
тандиона.
3.2. Влияние модификации остатков аргинина на кинетические параметры взаимодействия фермента с суб
стратами и комплексообразование его с 4С фе
нилаланилтРНК
3.3. Влияние субстратов на глубину модификации и степень инактивации фермента в реакциях обмена АТР
Рпирофосфат и аминоацилировэния тРНК.
Глава 4. Исследование роли остатков лизина во взаимодействии фенилаланилтРНКсинтетазы из . 0 с субстратами
4.1. Исследование влияния модификации остатков лизина с помощью 2,4пентавдиона на функционирование фермента
4.1.1. Модификация остатков лизина с помощью 2,4пентандиона . . .
4.1.2. Влияние низкомолекулярных лигандов на глубину модификации и степень инактивации фермента. Влияние модификации остатков лизина на кинетические параметры взаимодействия фермента с низкомолекулярными субстратами .
4.1.3. Влияние модификации остатков лизина на
взаимодействие фермента с тРНК
4.2. Модификация остатков лизина с помощью пиридоксаль5фосфата и аналогов субстратов АТР и фенилаланиниладенилата, окисленных по рибозе. . .
Глава 5. Модификация валил, тирозилтРНКсинтетаз из .i 0 и фенилаланилтРНКсинтетазы из i i по остаткам лизина с помощью 2,
пентандиона
Обсуждение результатов
Выводы.
Список литературы


Первый способ основан на определении природы аминокислотных остатков, защищаемых в составе комплекса фермента с субстратом от модификации, второй на определении аминокислотных остатков, модификация которых приводит к изменению кинетических параметров взаимодействия фермента с субстратами. Для модификации положительно заряженных остатков аминокислот лизина, аргинина в составе аминоацилтРНКсинтетаз был применен специфический реагент на остатки лизина и аргинина 2,4пентандион. В связи с тем, что некоторые остатки лизина, существенные для функционирования ферментов, могли оказаться недоступными для действия 2,4пентандиона, была сделана попытка локализовать эти аминокислотные остатки с помощью пиридоксальбфосфата, имеющего фосфатную группировку и ароматическое кольцо и способного, повидимому, взаимодействовать с нуклеотидсвязывающими центрами ферментов. Для выявления функциональной роли остатков лизина были использованы также аналоги субстратов АТР и аминоалкиладенилат, окисленные по ри
бозе перйодатом натрия. Основное исследование роли положительно заряженных остатков аминокислот было проведено с фенилаланилтРНКсинтетазой из Е. Ыл МРЕ 0. С целью выявления общности структурнофункциональной организации аминоацилтРНКсинтетаз исследовано влияние модификации остатков лизина на взаимодействие других АРСаз с субстратами. I.I. Количественная оценка электростатических взаимодействий в системе белок нуклеиновая кислота. Характерной чертой белковонуклеиновых взаимодействий является существование зависимости константы ассоциации комплекса белок нуклеиновая кислота от ионной силы раствора. Ригс и соавторы 4, 5 показали, что константа связывания репрессорного белка с оператором уменьшается приблизительно в 0 раз при увеличении концентрации моновалентных катионов в растворе от 0, М до 0, М. Подобные наблюдения были сделаны при изучении взаимодействия олиголизина с полирибонуклеотидами 6, связывания гистонов 7 и эстрадиолрецепторного белка 8 с ДНК, а также при исследовании взаимодействия белка гена бактериофага Т4 с нативной и денатурированной ДНК 9. Интерпретация этих результатов в рамках теории полиэлектролитов и теории комплексообразования II впервые дана Рекордом в году I . Р, у число моновалентных катионов М, связанных с
одной фосфатной группой нуклеиновой кислоты. При нейтрализации заряда фосфатной группы нуклеиновой кислоты в процессе образования ионной пары с лигандом освобождается Мионов. Для нативной двухцепочечной ДНК значение равно 0, I . Для случая, когда лиганд полиэлектролит, к число моновалентных ионов, участвующих в процессах конденсации и экранирования. Используя уравнения , Рекорд показал I, что для серии олиголизинов, взаимодействующих с поли Аполи 1 и с поли 1поли С б, количество ионных пар в комплексе олиголизин полирибонуклеотид равно количеству заряженных остатков лизина в олигомере. В рамках этого же подхода были оценены параметры связывания 1ас репрессора с неоператорной и операторной ДНК. Показано , что неспецифическое взаимодействие
вобождается к анионов. Тогда уравнение 2 может быть записано следующим образом
репрессора с неоператорной ДНК зависит от ионной силы рас
твора. Величина константы ассоциации уменьшается от Мх до I М1 при увеличении концентрации от 0,1 М до 0,2 М. Количество ионных пар, участвующих в образовании комплекса репрессорнеоператорная ДНК, приблизительно равно III, при условии незначительной конденсации моновалентных анионов на репрессоре . Специфическое взаимодействие репрессорного белка с операторной ДНК также зависит от ионной силы раствора, но в меньшей степени , . Таким образом, число электростатических контактов, образующихся при взаимодействии репрессора с оператором, составляет от количества ионных пар, участвующих в неспецифическом связывании репрессора с неоператорной ДНК. При исследовании взаимодействий РНКполимеразы с ДНК показано I6I9, что как неспецифическое, таки специфическое связывание минимального фермента и холофермента РНКполимеразы с ДНК чувствительно к концентрации соли. Так в 0, М М2 , 0, М величина константы ассоциации холофермента с про
моторным участком ДНК приблизительно равна 2 х М . Увеличение концентрации до 0, и 0,2 М приводит к уменьшению стабильности специфических комплексов в и раз, соответственно.