Изучение свойств ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5

• Автор: Голикова, Лариса Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 125 с. : ил

Более того, последние работы по определению первичной структуры ДНК целого ряда микроорганизмов выявили наличие в бактериальных клетках не одной как ранее предполагалось, а целого набора генов ДНКметилтрансфераз, что поднимает вопрос о роли такого каскада метилаз для функционирования клетки. Большинство метилаз является составной частью так называемой сайтспецифической системы рестрикциимодификации РМ системы бактериальных клеток, обозначаемых по видовому названию микроорганизмов и состоящих, как правило, из эндонуклеазы рестрикции и ДНКметилтрансферазы, узнающих одну и ту же последовательность нуклеотидов. Ранее было показано, что РМ система из i i 5 имеет сайт узнавания , аналогичный сайту узнавания хорошо известной РМ системы из штамма vi i. Однако эндонуклеаза рестрикции расщепляет ДНК иначе, чем , а оперон РМ системы 5I, в отличие от РМ системы , содержит, как минимум, три ДНКметилтрансферазы. ДНКметилтрансфераз, до настоящего времени не описаны в литературе. Целью данной работы явилось дальнейшее изучение РМ системы 5I, включая установление структуры всего оперона РМ системы и сравнительное исследование свойств выявленных ДНКметилгрансфераз. Определение структуры оперона уникальной системы рестрикциимодификации 5I и установление полной нуклеотидной последовательности генов ДНКметилтрансфераз и эндонуклеазы рестрикции, входящих в эту систему. Экспрессия генов ДНКметилтрансфераз системы рестрикциимодификации 5I в клетках . Установление субстратной специфичности всех ДНК метилтрансфераз системы ресгрикциимодификации . Определение оптимальных условий функционирования ДНКметилтрансфераз системы рестрикциимодификации i. Сравнительное изучение кинетических свойств новых ферментов ДНКметилтрансфераз системы ресгрикциимодификации 5I. В настоящее время известно около эндонуклеаз рестрикции и около 0 ДНКметилтрансфераз, специфически узнающих примерно 0 различных последовательностей ДНК . Преимущественно это бактериальные ферменты, являющиеся компонентами систем рестрикциимодификации. В состав РМ системы входит, как правило, эндонуклеаза рестрикции и модифицирующая ДНКметилтрансфераза, узнающие одну и ту же нуклеотидную последовательность длиной п. ДНКметилазы сайтспецифически модифицируют ДНК клеткихозяина, защищая ее от гидролиза соответствующей эндонуклеазой рестрикции. Таким образом, эндонуклеаза рестрикции может гидролизовать только чужеродную, потенциально опасную ДНК, например, ДНК фагов, внедряющуюся в бактериальную клетку 1,2. Биохимическими методами установлено, что около половины исследованных бактериальных штаммов несут одну или более систем рестрикциимодификации таблица 2. Следует отметить, что гены РМ систем являются квазимобильными элементами, о чем свидетельствует горизонтальный перенос этих генов между различными родами и видами бактерий 3, а так же явление изошизомерии ферментов и сходство их первичных и третичных структур . Секвенирование бактериальных геномов и их анализ показали, что гены ДНКметилаз и эндонуклеаз рестрикции могут встречаться значительно чаще и не входить в состав РМ систем . Таблица 2. Наличие РМ систем в различных микроорганизмах. I2 4. В 2. ДНКметилтрансфераз. В геноме цианобактерии viii РСС обнаружены 9 генов ДНКметилтрансфераз, четыре из них являются компонентами РМ систем, а пять охарактеризованы как одиночные . Хорошо известны одиночные ДНКметилтрансферазы и . Следует отметить, что метилазы, подобные . Более чем у 0 родов микроорганизмов идентифицировано около 0 специфичных изошизомеров ДНКметилаз . В качестве примеров можно привести М , М. Ы.Рти . Гены ДНКметилтрансфераз обнаружены не только в бактериальных клетках, но и в геномах вирусов, бактериофагов , и небольших геномах рода , включающих минимальный набор генов, необходимых для жизнедеятельности клетки ,. Например, ДНК вируса хлореллы 2 содержит генов метилтрансфераз и 2 гена эндонуклеазы рестрикции, что составляет 4 его генома . ДНКметилтрансферазы обнаружены и у высших эукариот, в таких группах как многоклеточные грибы, некоторые представители класса насекомых . X vi, и млекопитающие ,.