Получение и анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В

• Автор: Золова, Ольга Эдуардовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 111 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус гепатита В НВV. Общая характеристика

1.1.1. Краткая история обнаружения и исследования вируса гепатита В, его таксономическое положение

1.1.2. Структура вируса гепатита В

1.1.2.1. Белки оболочки вируса гепатита В.

1.1.2.2. Главный белок оболочки вируса гепатита В

малый поверхностный антиген

1.1.3. Организация генома вируса гепатита В

1.1.4. Особенности репродукции вируса гепатита В
1.1.5. Регуляция синтеза поверхностных белков ИВУ
1.1.6. Эпидемиология вируса гепатита В
1.2. Трансгенные растения возможные системы для
производства вакцин
1.2.1. Предпосылки для использования трансгенных
растений в качестве продуцентов вакцин
1.2.2. Съедобные вакцины и их получение в растениях
1.2.2.1. Использование химерных вирусных конструкций
в создании вакцинопродуцирующих растений
1.2.2.2. Получение растенийпродуценгов вакцин с использованием агробактериальной трансформации
1.2.2.3. Экспрессия в трансгенных растениях поверхностного антигена вируса гепатита В
1.2.3. Повышение уровня экспрессии трансгенов одна из
задач генноинженерной биотехнологии растений
1.2.4. Увеличение синтеза в грансгенных растениях одно из требований для разработки съедобных вакцин против гепатита Б
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Растения
2.3. Среды
2.3.1. Микробиологические среды
2.3.2. Среды для культивирования растений
2.4. Растворы
2.4.1. Другие растворы и буферы
2.5 Ферменты
2.6. Другие реактивы и материалы
2.7. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК
2.8. Конструирование плазмид дня трансформации растений
2.9. Введение метки в ДНК
2 Скрининг рекомбинантных клонов
2 Перенос ДНК на фильтры по Саузерну
2 Гибридизация на фильтрах по Саузерну
2 Трансформация листовых дисков табака
2 Выделение суммарной растительной ДНК
2 Определение активности неомицинфосфотрансферазы II Т
2 Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола
2 РНКДНК гибридизация
2 ПЦРанализ трансгенных растений
2 Определение содержания НВзантигена в трансгенных растениях
Подготовка пробы
. Процедура 5
2 Фракционирование белков из экстракта растений сульфатом аммония разных степеней насыщения 5
2 Иммуноблоттинг
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих
ген поверхностного антигена вируса гепатита В
3.1.1. Конструирование плазмид для трансформации растений, содержащих ген НВА под контролем одинарного и двойного промоторов Б РНК вируса мозаики цветной капусты
3.1.2. Генетическая трансформация растений табака 3.1.3 Молекулярнобиохимический анализ растений
табака, содержащих ген поверхностного антигена
вируса гепатита В
3.2. Анализ НВзантигена в трансгенных растениях табака
3.3. Анализ поколения Р1 трансгенных растений табака, содержащих ген под контролем двойного промотора Б
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Подробные исследования показали, что полученные в растениях и очищенные иммуногены после инъекции животным стимулировали образование иммуноглобулинов против соответствующих патогенов. В г. По ряду причин, во многих странах вакцины используются не так широко, как это необходимо. Вакцинные препараты, получаемые традиционными способами, дороги и требуют хранения в холодильниках, большинство вакцин вводятся парентерально, а это не всегда удобно при массовых иммунизациях. Кроме того, при получении вакцин с использованием культур клеток животных существует вероятность загрязнения вакцинных препаратов вирусами животных в г. У. Растения же являются безопасными системами для получения терапевтических белков, поскольку не содержат патогенных для млекопитающих вирусов. В растительных клетках есть необходимые механизмы ко и постгрансляшюнных модификаций, важных для активности многих полипептидов млекопитающих. Таким образом, преимущества растений для производства гетерологичных белков в том числе вакцин, по сравнению с другими системами бактериальными, дрожжевыми, животными клетками и трансгенными животными, очевидны растительную биомассу можно нарабатывать в неограниченных количествах при небольших энергетических затратах, при этом исключается вероятность контаминации вакцин патогенными вирусами животных, а так же имеются все условия для полноценного синтеза функциональных эукариотических белков. Исходя из вышесказанного, растения могут быть перспективными объектами для разработки новых безопасных технологий производства вакцин, в частности, против гепатита В. Вирусный гепатит В одна из широко распространенных инфекций человека, которая приводит к тяжелым последствиям, в том числе к хроническим поражениям печени, переходящим в цирроз и рак печени. В настоящее время на Земном шаре официально зарегистрировано около 0 миллионов человек, инфицированных вирусом гепатита В, однако по данным исследований Всемирной Организации Здравоохранения фактическое число носителей этого вируса около двух миллиардов. Эффективных средств лечения гепатита В пока не существует. До сих пор наилучшим способом защиты от данной болезни является вакцинация. Современные прививочные препараты против гепатита В предназначены для парентерального применения, причем требуется несколько инъекций для создания защитного уровня антител в организме привитого. Кроме того, процедура очистки их основного компонента поверхностного антигена вируса гепатита В, сложная и дорогостоящая, что ограничивает использование таких вакцин. В г. Мэйсоном с соавторами впервые получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген поверхностного антигена Л вируса гепатита В. Было показано, что рекомбинантный белок НВБантиген подвергается необходимому гликозилированию в растениях, собирается в вирусоподобные частицы и сохраняет иммуиогенные свойства. Интересны последние исследования в области получения растений, синтезирующих НВБантиген оказалось, что пероральное применение определенных доз таких растений совместно с однократным парентеральным введением субиммуногенной дозы коммерческой вакцины приводит к появлению высокого уровня антител против . Эти данные открывают новые перспективы для использования растений, продуцирующих иммуиогенные белки. Цель данной работы создание растений табака, экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В. Вирус гепатита В V. Поверхностный антиген вируса гепатита В был впервые идентифицирован в крови австралийского аборигена и назван австралийским антиген шл . Было установлено, что антиген обнаруживается у пациентов, страдающих сывороточным гепатитом типа В i . Впоследствии были найдены частицы, ассоциированные с антигеном частицы Дейна . Вирусную природу этих частиц подтвердили, обнаружив внутри их сердцевины эндогенную ДНКполимеразу . В i . В конце х годов, с появлением технологии рекомбинантных ДНК, геном V был клонирован в бактериях ii i . Благодаря этому стало возможным получать компоненты вируса в большом количестве для его дальнейшего изучения. Были обнаружены и другие родственные Vвирусы, например, вирусы гепатита В сурка . Все они относятся к семейству Гепадновирусов vii.