Изучение транскрипционного фактора TRF2 у Drosophila melanogaster

• Автор: Копытова, Дарья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Оглавление.

Список сокращений

1. Введение. в

2. Обзор литературы

I iii x

РНКполимераза II

РНК полимераза И и его .

Холофермент РНКполимеразы П.

Свойства коровых промоторных элементов РНК полимеразы II

ТАТА бокс

ТАТАсвязывающие факторы.

Инициаторный элемент 1пг.

II распознающий элемент.
Проксимальный элемент xi
Другие коровые промоторные элементы
островки i.
ТВР
II
II
II.
Корегуляторы 0 0 00000
.
Медиаторный комплекс
Семейство ТВРподобных факторов
2
2 необходим для эмбрионального развития и дифференцировки.
2 мыши необходим для сперматогенеза.
2 управляемая промоторселективная генная экспрессия у дрозофилы
Регуляторный ген i Iii x 00i0000
Объект и задачи исследования 000
2. Программное обеспечение Базы данных
3. Работа с ДНК.
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной
ДНК. Рестрикция, лигирование, переосаждение ДИК, гельэлектрофорез
Введение радиоактивной метки в ДНКзонд.
5. Работа с РНК.
Выделение тотальной I I
Очистка РНК.
Получение кДНК, ОТПЦР, З.
Нозерн анализ
6. Генетические скрещивания, фенотипический анализ 2 мутантов
7. Работа с белками.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков.
Получение антител и их очистка.
Белковый гельэлектрофорез.
Иммуноблоттинг.
.
Выделение эмбрионального ядерного экстракта
Хроматография
Получение белковых экстрактов из эмбрионов.
8. Гибридизация i i.
Гибридизация семенников i i
9. Иммуноокрашивание
Иммуноокрашивание политенных хромосом
Иммуноокрашивание эмбрионов
Иммуноокрашивание яичников и семенников
. Работа с эмбриональными клетками ..
4.Результаты
1. Изучение структу ры гена 2 а
Картирование мутации .
Исследование влияния мутации на уровень экспрессии гена 2.
Клонирование кДНК 2.
2.Изучение белков, кодируемых геном 2
3. Иммуноокрашивание хромосом и хроматография в
Локализация на политенных хромосомах слюнных желез i . Хроматографическое исследование.
3. Анализ гомологов 2 у различных видов i а
4. Анализ экспрессии гена ннт.м.м.ммиии..и.
Нозерн развития.
Нозерн тканей.
Вестерн блот гибридизация тканей
Иммуноокрашивание яичников
Иммуноокрашивание семенников антителами к 2 и ТВР
Гибридизация семенников i i.
Вестерн блот анализ семенников мутантных мух
5. Обсуждение результатов
6. Выводы мааааааааамамааа1аамааммаамаамаамаааамамааааамаамаамаавааамааиаамаамааа1мамаа1а1аааамаааавам1мама
Благодарности
Список литературы


Как и ТВР, большинство членов 2 семейства имеют высоко консервативный Сконцевой коровый домен, содержащий два симметричных повтора, и вариабельный концевой домен. Как было показано, 2 активирует транскрипцию РНКполимеразой II и взаимодействует с II и II, компонентами преинициаторного комплекса РНКполимеразы И. Однако несмотря на структурное сходство с ТВР, 2 не связывает классический ТАТА бокс и, возможно, контролирует транскрипцию определенного набора генов, отличного от такового у ТВР ,1,4, 6, 3. Показано, что у С. X 2 необходим для эмбриогенеза, в то время как у мыши 2 не нужен для раннего развития, но необходим для сперматогенеза , 7. У . ДНК 2 содержащая открытую рамку считывания ОРС для белка длиной 2 ак 6. Однако структура гена 2 и функция 2 у . Целью данной работы было изучение функции 2 в развитии i . Использовались разнообразные физикохимические методы работы с ДНК, РНК, белками, методы биоинформатики. Исследована экспрессия гена, показано, что в дополнение к 2 полипептиду, описанному ранее, 2 ген кодирует более длинный полипептид, размером 5 кДа. Продемонстрировано, что 2 является тканеспецифичным фактором и необходим на разных стадиях развития i . Регуляция транскрипции является ключевым шагом в контроле экспрессии генов. В данном процессе происходит комбинаторное взаимодействие регуляторных элементов ДНК и многих транскрипционных факторов. Недавние исследования показали, что многоклеточные организмы обладпют специализированными комплексами инициации транскрипции и промоторными последовательностями, которые координированно управляют регуляцией генов. Регуляция транскрипции намного более сложна у эукариот, нежели у микроорганизмов. У микроорганизмов регулируются 0 генов, их промоторы находятся в пределах 00 п. ДПКсвязывающими белками. ДПКсвязывающими белками. Кроме того, животные имеют 0 типов клеток. Изучение экспрессии выбранных случайным образом генов в эмбрионах дрозофилы показало, что даже среди клеток одного клеточного типа, большинство мРНК экспрессируются на различном уровне , . Так, в сущности, каждая клетка у животных может иметь уникальный уровень транскрипции генов. i , в настоящее время является наиболее удобной моделью для изучения. Трансгенный анализ в этих организмах быстр и дешев 5, 3. Несмотря на высокую сложность, модель i проще, чем V. Результатом этого является глубокое изучение механизмов транскрипции эукариот на примере i . Для инициации транскрипции белоккодирующих генов необходимо образование преинициаторного комплекса I, состоящего из матрицы ДНК, РНКполимеразы II и 5 общих транскрипционных факторов. Образование I происходит посредством связывания ТВР, субъединицы II, с ТАТА боксом, последующего согласованного привлечения II, комплекса нефосфорилированной РНКполимеразы П с II, II и II. После изменения промотора и инициации транскрипции, домен большой субъединицы РНКполимеразы II фосфорилируется. Это событие приводит к началу элонгации транскрипции. Последующая терминация фосфатазное возвращение РНКполимеразы II в ее нефосфорилированную форму позволяет и РНКполимеразе II инициировать следующий раунд транскрипции. РНКполимераза II является ферментом, ответственным за транскрипцию белоккодирующих генов у эукариот. РНКполимераза II катализирует ДНКзависимый синтез мРНК, но не способна инициировать промоторзависимую транскрипцию или отреагировать на действие регуляторных белков транскрипции в отсутствие других факторов. Современное представление о механизме инициации транскрипции изменилось после открытия возможности транскрипции в бесклеточных системах. Оказалось, что очищенная РНКполимераза II млекопитающих может избирательно инициировать транскрипцию с матрицы ДИК при добавлении ее в клеточный экстракт грубой очистки. Этот факт позволил в дальнейшем идентифицировать , факторы, необходимые для аккуратной инициации транскрипции IIполимеразой II i vi.