Особенности структуры и транспорта связывающих субъединиц рибосом-инактивирующих белков растительного происхождения

• Автор: Фаттахова, Гульнар Ваисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

Синеок сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Строение связывающих субъединиц растительных РИБ И

1.1.1. Структура углеволсвязываюгаих сайтов

1.2. Внутри и межмолекулярные взаимодействия субьединиц рицина и вискумина

1.3. Углеводная специфичность и рецепторы рицина и вискумина

1.4. Г.тикозилироаание иммуноглобулинов

1.5. Внутриклеточный транспорт белковых токсинов

1.5.1. Эндоцитоз

1.5.2. Механизмы везикулярною транспорта
1.5.2.1. Роль цитозольных белков в процессе слияния мембран
1.5.2.2. Белки семейства регуляторы везикулярного транспорта
1.5.3. Прохождение через жаосоыальиый комиартмеит
1.5.4. Транспорт РИБ II через аппарат Гольджи
1.5.4.1. Белки аппарата Гольджи .
1.5.5. Ретроградный транспорт в эндоплазматический ретикулум
1.5.6. Транслокация токсинов
1.5.7. Влияние низкомолскулярных метаболитов на транспорт токсинов
1.6. Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Vi
2.2. Выделение токсинов и их субъединиц из растения ii i
2.3. Гибридомы и моноклональные антитела
2.4. Определение концентрации белков
2.5. Биотинилированис белков
2.6. Электрофорез в системе Лэммли
2.7. Окрашивание геля
2.8. Элсктропсрснос белков на нитроцеллюлозную мембрану
2.9. Иммуноблотпшг
2. Визуализация внутриклеточных сайтов связывания субъединиц РИБ II
2 Аффинная хроматография
2 Рентгсноструктурный анализ
2 Получение НТСмеченых конъюгатов
2 Получение белков, меченых флуорофором Аеха Пиог 8
2 Хроматографический анализ флуоресцентномеченых белков
2 Ведение клеточных культур
2 Получение мембранных фракций
21 олучсннс клеточных лизатов
2 Конфокальная микроскопия
2 Оценка цнтотокснческого действия токсинов
2 Твердофазный иммуноферментный анализ ЕЫБА
21. Изучение взаимодействия асиалофстуина и мышиных иммуноглобулинов с токсинами
22. Твердофазный иммуноферментный анализ флуоресцентномеченых токсинов
2 Определение констант ассоциации
Глава 3. Результаты н обсуждение
3.1. Изучение углеводсвязывающих центров вмекумнна
3.2. Изучение связывания лектинов с глнкопротеннами асиалофетунном и иммуноглобулинами
3.3. Изучение связывания растительных токсииов и их субъединиц с клеточными белками
3.4. Изучение транспорта рицина и внекумина методом лазерной конфокальной микроскопии
Выводы
Список литературы


Аминокислотная последовательносгь была определена Вцспь внекумина имеет молекулярную массу кДа и состоит из 4 аминокислот, включающие семь остатков цистеина. Остаток цистеина образует межмолекулярную дисульфидную связь с Су0 Асубъсдиницы, а шесть остальных остатков образуют три внутримолекулярные дисульфилныс связи. Более детальное изучение аминокислотной последовательности позволяет предсказывать наличие трех потенциальных сайтов глнкозилирования , что было затем подтверждено методами массспскгроскопии. , содержащий углеводную цепь с молекулярной массой, близой к массе олигосахаридов , обнаружен н в молекуле . Таким образом, в обеих цепях, повидимому, содержатся одни и те же углеводные звенья. Относительно высокое содержание углеводов около вероятно обусловлено значением с вязанных олигосахаридов, позволяющих сохранить биологически активную конформацию белка. При выравнивании аминокислотных последовательности Вцепм вискумина с последовательностями , АВВ рис. Наиболее консервативный участок расположен в области конца. Аминокислотные остатки, входящие в углеводсвязывающие сайты молекулы , также присутствуют в , , , , субдомсн , 4, I6, 8, 5, 6 субломсн 2, и трипептнд V. Все эти остатки занимают соответствующие позиции в молекуле Вцепи вискумина Вышеупомянутый трипептнд также располагается в первом углеводсвязывающем домене V, а во втором позиции 68 8 заменен на . Результаты исследования , , могут свидетельствовать в пользу того, чго и I имеют очень схожую пространственную организацию, в которой углсводсвязываюшис центры находятся в одинаковом положении. Эха гипогеза согласуется с предположением, что зги лектины могли образоваться в ходе одних и тех же эволюционных процессов. Данные рснтгеноструктурного анализа позволяют выявить значгельнос сходство пространственной организации Вцспсй растительных РИБ II. Связывающие субъединицы состоят из двух доменов, каждый из которых представляет собой структуру ртрилисгника. 1I. I. I IIII. VI. V. VI. I. V. I1I1 . Рис 1. Сравнение аминокислотной последовательности Всубъединицы вискумина с асннокислотными последовательностями Всубъсдиниц РИБ I типа рицина и абрина , АВВ соответственно. Последовательности выравнены в соответствии с наиболее консервативными аминокислотными остатками. Участки гликозилирования подчеркнуты. АК остатки, аходящне в активный центр белков отмечены звездочкой вверху колонки. Структура углеодсвя Известно, что Вцепи РИЬ II обладают углсводсвязываюшсй активностью, и специфично взаимодействуют с компонентами плазматической мембраны, содержащими определенные углеводные остатки. На сегодняшний день в литературе описаны токсические лекгнны, специфически связывающие осгагакн ЗаМЗаЖАс, причем рицин является наиболее изученным. Анализ аминокислотной последовательности Вцепи и определение трехмерной структуры с помощью РСА показало, что Вцспь состоит из двух гомологичных, топологически схожих доменов 1 и 2, каждый из которых содержит по три гомологичных субдомена а, р, у и связывающим линкерный трипептнд а. Предлагается. УПЫгапса сс. Согласно теории, высказанной ЯиюпЬег с1 а1. Вцепи явился 1асубдомен, гак как только эта полипешидная единица сохраняла все ключевые структуры и функциональные особенности. Удвоение гена и слияние привело затем к образованию молекулы типа схРу. Добавление лнептида стабилизировало структуру. Галактозидсвязывающие центры ограничены с одной стороны боковыми ароматическими радикалами Тгр и Туг8 в субдоменах 1а и 2у соотвстсгвснно, и с другой стороны три пептидами в субдомене 1и н 68 в субдомснс 2у. Эти галактозидсвязывающие сайты расположены на противоположных концах Вцспи, на расстоянии около А друг относительно Друга.