Развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов Escherichia coli: от Mu-зависимой "случайной" интеграции до сайт-специфических перестроек хромосомы

• Автор: Минаева, Наталья Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

1Л. Гомологичная рекомбинация и ДНКинженерия. 9 1Л Л. Г омологичная рекомбинация.

1.1.2. ДНКинженерия на основе гомологичной рекомбинации.

1.2. Бактериофаг Ми как инструментарий для генной инженерии. 1.2Л. Бактериофаг Ми и его производные.

1.2.2. Интегративные системы на основе бактериофага Ми.

1.3. Методы модификации бактериальной хромосомы с помощью сайтспсцифической рекомбинации.

1.3.1. Сайтсиецифическая рекомбинация.

1.3.2. Семейства рекомбиназ.

1.3.3 Сайтспецифические рекомбинационные системы, наиболее часто применяемые для модификации бактериального генома. 1.3.3Л. ХегСХегЭ система.

1.3.3.2. Сгеох система.

1.3.3.3. Г1рй1 система.

1.3.3.4. АЛпХб система

1.3.4. Области применения сайтспецифической рекомбинации. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТО ДЛ
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и среды.
2.2. Олигонуклеотиды.
2.3. Проведение полимеразной цепной реакции.
2.4. Генноинженерные методики.
2.5. 1 зависимая трансдукция.
2.6. Элсктротрансформация клеток .i.
2.7. Конструирование рекомбинантных плазмид.
2.8. зависимая интеграция в геном .i кассеты, содержащей оперон ii4 5 и ген в качестве селективного маркера.
2.9. Инте1рация фрагментов ДНК в бактериальную хромосому, с использованием зависимой системы рекомбинации бактериофага X. Удаление маркера устойчивости из хромосомы.
2 Замена гена в интегрированной в хромосому штамма кассете ,ас.са на вырезаемый маркер .
2 Конструирование штаммов с делецией природного р и различной локализацией искусственных р сайтов.
2 финтсграция плазмид.
2 Тестирование функциональности искусственных сайтов в штаммах 3 i.
2 Измерение активности. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка генноинженерного инструментария для конструирования бесплазмидных безмаркерных рекомбинантных штаммов.
3.1.1. Применение ii системы для интеграции целевых генов в бактериальную хромосому.
3.1.2. Замена селективного маркера в интегрированной кассете ii на вырезаемый маркер с помощью системы фага X.
3.2. Разработка новой стратегии интеграции генетического материала на основе сайтспецфической системы рекомбинации.
3.2.1. Конструирование штаммов с различной локализацией ф сайтов.
3.2.2. Конструирование фиитсгративной I плазмиды с Xiвырезаемой векторной частью.
3.2.3. Использование новой системы для множественной интеграции гена в хромосому .i. ВЫВОДЫ
С ИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


Применение ii системы для интеграции целевых генов в бактериальную хромосому. Замена селективного маркера в интегрированной кассете ii на вырезаемый маркер с помощью системы фага X. Разработка новой стратегии интеграции генетического материала на основе сайтспецфической системы рекомбинации. Конструирование штаммов с различной локализацией ф сайтов. Конструирование фиитсгративной I плазмиды с Xiвырезаемой векторной частью. Использование новой системы для множественной интеграции гена в хромосому . Конструирование бесплазмидных безмаркерных бактериальных штаммовпродуцентов биологически активных веществ является необходимым условием их дальнейшего использования в современном биотехнологическом производстве. В настоящее время появляется все больше данных о том, что наличие в бактериальных клетках плазмид может негативно сказываться на жизнеспособности клеток, а именно значительно изменять клеточный метаболизм, замедлять рост бактерий, что во многих случаях нежелательно при создании промышленных штаммовпродуцентов . Несомненный интерес к созданию нового поколения бссплазмидных штаммовпродуцентов обусловлен определенными запретами на использование плазмид в крупных микробиологических производствах по соображениям их возможного нежелательного распространения среди микроорганизмов окружающей среды. Кроме того, обычно, продуценты конструируются с помощью последовательных хромосомных модификаций, при которых требуется проведение многократных интеграций генетического материала в бактериальную хромосому, что вызывает ряд проблем, связанных с ограниченным набором селективных маркеров и законодательным ограничением на их применение. Поэтому усовершенствование генноинженерного инструментария, предназначенного для конструирования бесплазмидных безмаркерных штаммовпроду центов, является актуальным и практически значимым. Исходя из наметившихся тенденций в современной биотехнологии, создаются бесплазмидные безмаркерные штаммыпродуценты биологически активных веществ, образование которых в естественных условиях является результатом скоординированной деятельности нескольких ферментов. Такие штаммы конструируют с помощью последовательных хромосомных модификаций, включающих делеции или замены небольших участков генома, а также встраивания протяженных фрагментов ДНК с генамиопероиами. Для осуществления первых двух указанных типов модификаций в случае продуцентов, создаваемых на основе штаммов Е. АДебЕТзависимая рекомбинация небольших фрагментов ДНК с бактериальной хромосомой . Для интеграции протяженных фрагментов использую различные системы на основе транспозонов и фага для инсерций в случайную точку генома М. V., ii , . Ахвердян В. З. и др. X, ф и др. Кроме того, возможно объединение нескольких разработанных систем в одной стратегии. Например сайтспецифическая встройка кассеты может быть проведена в предварительно интегрированный случайным образом рекомбинационный сайт . С. , или маркированная кассета может быть интегрирована случайным образом с последующим вырезанием селективного маркера с помощью сайтспецифической рекомбинации , , При детальном рассмотрении предложенных методов можно обнаружить ряд недостатков, которые могут ограничивать их применение для конструирования штаммовпродуцентов. В связи с этим представлялось актуальным разработать новую стратегию конструирования, использующую достоинства известных систем и обеспечивающую возможность прецизионного дизайна всех планируемых модификаций. Диссертационная работа посвящена разработке нового генноинженерного инструментария для направленной модификации бактериального генома при создании бссплазмидных рекомбинантных штаммов . Разработана новая система, позволяющая интегрировать генетический материал гены или опероны в определенные несущественные точки хромосомы . Данная система является удобным генноинженерным инструментарием, прикладным назначением которого является конструирование бесплазмидных безмаркерных штаммовпроду центов биологически активных веществ на основе . Осуществлено конструирование библиотеки штаммов .