Диссертация на тему "Поиск белков, взаимодействующих с новым транскрипционным фактором Е(у)2", скачать бесплатно автореферат по специальности 03.00.03

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ. в

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. 5содержащие комплексы многоклеточных.

Транскрипция и ацетилирование

Структурная организация 5 и белков и их функции.

Два различных ХлЧ5содержащих комплекса многоклеточных и их состав.

5содержащие подобные комплексы массой 2 МДа.

5содержащие АТАС комплексы массой 0 кДа.

Трехмерная структура подобных комплексов.
Функции 5содержащих комплексов.
II. Экспорт мРНК и транскрипция.
Рецептор и адаптеры экспорта мРНК.
X комплекс.
3 комплекс.
III. Транскрипция на периферии ядра.
Эпигенетическое состояние генома.
Транскрипционно неактивный хроматин и ядерная периферия.
Репрессия теломер у дрожжей.
Ядерная яамипа и репрессия генов.
Транскрипционно активные гены на периферии ядра.
Факторы, влияющие на связывание транскрипционно активных генов с .
Влияние мРНК на прикрепление генов к ядерным порам.
комплекс участвует в организации связывания генов с ядерной порой.
IV. Инсуляторы.
Организация эукариотических геномов.
зависимые инсуляторы.
Строение и белковый состав ix.
Энхансерблокирующая активность
Барьерная активность БиНминсуляторов.
Модели функционирования инсуляторов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
I. Объект и задачи исследования.
II. Материалы и методы.
1. Материалы.
Штаммы и вектора . vii и . i.
Клеточные линии.
Библиотека кДНК.
Эмбриональный ядерный экстракт.
Дрожжевые и бактериальные среды.
Ферменты и реактивы.
Антитела.
Праймеры.
Конструкции для двухгибридного скрининга.
Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков.
Конструкции для трансформации 2 клеток.
2. Работа с дрожжами.
3. Работа с клетками.
Трансформация Б2 клеток.
РНК интерференция.
4. Работа с ДНК.
Приготовление компетентных клеток.
Трансформация бактерии.
Щелочное выделение плазмидной ДНК.
Обработка ДНКрестриктазами.
Лигирование.
Выделение геномной ДНК из мух. .
Гельэлектрофорез ДНК. 5
Секвенирование ДНК.
5. Работа с РНК.
Получение двухцепочечной РНК.
Выделение РНК.
БТРСК
Нозернблот анализ.
6. Работа с белками.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков.
Связывание белков на глютатионсефарозе.
Получение антител и их очистка.
Белковый гельэлектрофорез.
Вестернблот анализ
Соосаждение белков антителами.
Дотблот анализ.
7. И.ммуноокрашивание.
Иммуноокрашивание политеиных хромосом.
Иммуноокрашивание 2 клеток.
8. Гибридизация i i.
РНК i i гибридизация с СуЗi праймером.
ДНК i i гибридизация с зондом к индивидуальному гену.
9. Электронная микроскопия.
. Анализ изображений.
И. Хроматиниммунопреципитация.
. Использованное программное обеспечение.
III. Результаты. Поиск белков, взаимодействующих с Еу2, в дрожжевой двухгибридной системе. Изучение взаимодействия Еу2 с компонентами комплекса дрозофилы. Изучение внутриклеточной локализации Еу2 и компонентов
комплекса дрозофилы.
Исследование внутриядерной локализации Еу2 при помощи электронной микроскопии.
Изучение взаимодействия Еу2 с белком X2 Xi i2.
Исследование влияния Еу2 и X2 на экспорт мРНК из ядра в цитоплазму.
Изучение влияния Еу2 и X2 на экспорт транскриптов генов.
Изучение влияния Еу2 и X2 на расположение локусов внутри ядра.
Изучение влияния Еу2 и X2 на регуляцию транскрипции генов.
Анализ взаимодействия Еу2 с белком .
Изучение взаимодействия Еу2 и i viv.
Анализ взаимодействия Еу2 с инсуляторами.
Изучение влияния Еу2 на функции 8иНузависимых инсуляторов.
IV. Обсуждение результатов.
Основные результаты.
Еу2 новый компонент БАСАТРГС комплекса дрозофилы.
Еу2 входит с состав нового комплекса, осуществляющего экспорт мРНК.
Еу2 в комплексе с Хша2 осуществляет прикрепление юр локусов к ОТС.
Еу2 координирует транскрипцию генов, прикрепление к КРС и экспорт мРНК.
Биологический смысл прикрепления Л локусов к ядерной норе.
Еу2 новый белковый компонент БиНузависимых инсуляторов.
Возможные механизмы барьерной активности 8иНуинсуляторов.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Носителями наследственной информации являются гены, а процесс ее реализации называется экспрессией генов. Экспрессия генов представляет собой сложный многостадийный процесс. Он включает следующие этапы транскрипцию и процессинг мРНК в ядре, экспорт мРНК из ядра в цитоплазму через ядерные норы, трансляцию в
цитоплазме и, наконец, деградацию мРНК и белков. Хотя изначально эти процессы, рассматривались и изучались, как полностью независимые друг от друга, в последнее время становится понятным, что i viv они тсспым образом взаимосвязаны. Гак транскрипция влияет на процессинг и экспорт мРНК, и наоборот нарушения процессинга способны иметь негативный эффект на транскрипцию. Молекулярные механизмы, обеспечивающие такую координацию различных стадий экспрессии генов друг с другом, еще очень слабо изучены. Транскрипция является ключевым этапом экспрессии генов. Регуляция транскрипции обеспечивается при помощи чрезвычайно сложно устроенных клеточных систем, включающих цисдсйствующие элементы разнообразные регуляторные элементы генома и трансдействующие элементы многочисленные факторы транскрипции. Эукариотическая ДНК упакована в хроматин, который способен
находиться в различных состояниях, отличающихся прежде всего степенью компактизации и транскрипционной активностью. Поддержание и изменение структуры хроматина является важнейшими факторами, влияющими на экспрессию генов, так как определяют степень доступности ре1уляторньтх элементов действию транскрипционных факторов. Одним из факторов, регулирующих организацию хроматина, является пространственное распределение хроматина в ядре клетки, в частности, взаимодействие хроматина с белками, ассоциированными с ядерной оболочкой. Также в формировании, раздельных функциональных доменов хроматина принимают участие регуляторные элементы, называемые иисуляторами. Одно из свойств инсулятора состоит в способности препятствовать распространению гетерохроматина на близлежащие эухроматииовые области. В клетке имеется ряд комплексов, способных изменять структуру хроматина и, таким образом, регулировать транскрипцию, к ним относятся и комплексы, осуществляющие различные химические модификации гистопов. В настоящее время, большое количество исследований посвящено изучению транскрипционных факторов и принципов их работы. Конечной целью является понимание работы молекулярного аппарата транскрипции. Ранее в нашей лаборатории был впервые описан новый коактиватор транскрипции эволюционно консервативный белок Еу2. Было предположено, что Еу2 вовлечен в регуляцию транскрипции большого числа генов в ходе развития дрозофилы. Было показано, что Еу2 коактивирует транскрипцию на хроматиновой матрице и входит в состав миогосубъединичиого комплекса, содержащего белок ТАЕ9. Целыо данной работы являлось изучение функций Еу2. Было показано, что Еу2 входит в состав БАСАЛТГС гистонацетилтрансфсразного комплекса дрозофилы, являясь новым, ранее не описанным компонентом этого комплекса. Хтаз2 и вместе с ним входит с состав нового ассоциированного с ядсрной порой комплекса, который участвует в организации экспорта мРНК. На модели кластера 8АСАТРТСзависимых генов теплового шока А мы показали, что Еу2 является белком, координирующим транскрипцию Ыр генов, их прикрепление к ЫРС и экспорт мРНК. Таким образом, впервые в многоклеточном организме был описан белок, осуществляющий физическую связь между транскрипцией генетического локуса, его внутриядерным положением и экспортом его транскриптов. Также впервые было показано, что Еу2 связывается с белком ЗиНу и является белковым компонентом 5иНзависимых инсуляторов МДГ4 и 1А2. Еу2 необходим для барьерной активности данных инсуляторов. Полученные результаты позволили предложить модель работы 8иНшзависимых инсуляторов как барьерных элементов. Таким образом, в данной работе сделан шаг в понимании функций инсуляторов и, следовательно, в развитие представлений о механизмах функциональной организации хроматина. В целом, проведенное исследование вносит вклад в понимание функций Еу2 и, следовательно, в общую картину организации экспрессии генов.

Название работы	Автор	Дата защиты
Клонирование и характеристика новых генов нейропептидов виноградной улитки	Потеряев, Дмитрий Александрович	1999
Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики цитомегаловирусной инфекции	Суслопаров, Иван Михайлович	2006
Пространственная организация ДНК в ядре и индуцированные ДНК-топоизомеразой II хромосомные перестройки	Кантидзе, Омар Леванович	2007

Электронная библиотека диссертаций

Поиск белков, взаимодействующих с новым транскрипционным фактором Е(у)2