Диссертация на тему "Поиск белков, взаимодействующих с новым транскрипционным фактором Е(у)2", скачать бесплатно автореферат по специальности 03.00.03

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ. в

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. 5содержащие комплексы многоклеточных.

Транскрипция и ацетилирование

Структурная организация 5 и белков и их функции.

Два различных ХлЧ5содержащих комплекса многоклеточных и их состав.

5содержащие подобные комплексы массой 2 МДа.

5содержащие АТАС комплексы массой 0 кДа.

Трехмерная структура подобных комплексов.
Функции 5содержащих комплексов.
II. Экспорт мРНК и транскрипция.
Рецептор и адаптеры экспорта мРНК.
X комплекс.
3 комплекс.
III. Транскрипция на периферии ядра.
Эпигенетическое состояние генома.
Транскрипционно неактивный хроматин и ядерная периферия.
Репрессия теломер у дрожжей.
Ядерная яамипа и репрессия генов.
Транскрипционно активные гены на периферии ядра.
Факторы, влияющие на связывание транскрипционно активных генов с .
Влияние мРНК на прикрепление генов к ядерным порам.
комплекс участвует в организации связывания генов с ядерной порой.
IV. Инсуляторы.
Организация эукариотических геномов.
зависимые инсуляторы.
Строение и белковый состав ix.
Энхансерблокирующая активность
Барьерная активность БиНминсуляторов.
Модели функционирования инсуляторов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
I. Объект и задачи исследования.
II. Материалы и методы.
1. Материалы.
Штаммы и вектора . vii и . i.
Клеточные линии.
Библиотека кДНК.
Эмбриональный ядерный экстракт.
Дрожжевые и бактериальные среды.
Ферменты и реактивы.
Антитела.
Праймеры.
Конструкции для двухгибридного скрининга.
Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков.
Конструкции для трансформации 2 клеток.
2. Работа с дрожжами.
3. Работа с клетками.
Трансформация Б2 клеток.
РНК интерференция.
4. Работа с ДНК.
Приготовление компетентных клеток.
Трансформация бактерии.
Щелочное выделение плазмидной ДНК.
Обработка ДНКрестриктазами.
Лигирование.
Выделение геномной ДНК из мух. .
Гельэлектрофорез ДНК. 5
Секвенирование ДНК.
5. Работа с РНК.
Получение двухцепочечной РНК.
Выделение РНК.
БТРСК
Нозернблот анализ.
6. Работа с белками.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков.
Связывание белков на глютатионсефарозе.
Получение антител и их очистка.
Белковый гельэлектрофорез.
Вестернблот анализ
Соосаждение белков антителами.
Дотблот анализ.
7. И.ммуноокрашивание.
Иммуноокрашивание политеиных хромосом.
Иммуноокрашивание 2 клеток.
8. Гибридизация i i.
РНК i i гибридизация с СуЗi праймером.
ДНК i i гибридизация с зондом к индивидуальному гену.
9. Электронная микроскопия.
. Анализ изображений.
И. Хроматиниммунопреципитация.
. Использованное программное обеспечение.
III. Результаты. Поиск белков, взаимодействующих с Еу2, в дрожжевой двухгибридной системе. Изучение взаимодействия Еу2 с компонентами комплекса дрозофилы. Изучение внутриклеточной локализации Еу2 и компонентов
комплекса дрозофилы.
Исследование внутриядерной локализации Еу2 при помощи электронной микроскопии.
Изучение взаимодействия Еу2 с белком X2 Xi i2.
Исследование влияния Еу2 и X2 на экспорт мРНК из ядра в цитоплазму.
Изучение влияния Еу2 и X2 на экспорт транскриптов генов.
Изучение влияния Еу2 и X2 на расположение локусов внутри ядра.
Изучение влияния Еу2 и X2 на регуляцию транскрипции генов.
Анализ взаимодействия Еу2 с белком .
Изучение взаимодействия Еу2 и i viv.
Анализ взаимодействия Еу2 с инсуляторами.
Изучение влияния Еу2 на функции 8иНузависимых инсуляторов.
IV. Обсуждение результатов.
Основные результаты.
Еу2 новый компонент БАСАТРГС комплекса дрозофилы.
Еу2 входит с состав нового комплекса, осуществляющего экспорт мРНК.
Еу2 в комплексе с Хша2 осуществляет прикрепление юр локусов к ОТС.
Еу2 координирует транскрипцию генов, прикрепление к КРС и экспорт мРНК.
Биологический смысл прикрепления Л локусов к ядерной норе.
Еу2 новый белковый компонент БиНузависимых инсуляторов.
Возможные механизмы барьерной активности 8иНуинсуляторов.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Носителями наследственной информации являются гены, а процесс ее реализации называется экспрессией генов. Экспрессия генов представляет собой сложный многостадийный процесс. Он включает следующие этапы транскрипцию и процессинг мРНК в ядре, экспорт мРНК из ядра в цитоплазму через ядерные норы, трансляцию в
цитоплазме и, наконец, деградацию мРНК и белков. Хотя изначально эти процессы, рассматривались и изучались, как полностью независимые друг от друга, в последнее время становится понятным, что i viv они тсспым образом взаимосвязаны. Гак транскрипция влияет на процессинг и экспорт мРНК, и наоборот нарушения процессинга способны иметь негативный эффект на транскрипцию. Молекулярные механизмы, обеспечивающие такую координацию различных стадий экспрессии генов друг с другом, еще очень слабо изучены. Транскрипция является ключевым этапом экспрессии генов. Регуляция транскрипции обеспечивается при помощи чрезвычайно сложно устроенных клеточных систем, включающих цисдсйствующие элементы разнообразные регуляторные элементы генома и трансдействующие элементы многочисленные факторы транскрипции. Эукариотическая ДНК упакована в хроматин, который способен
находиться в различных состояниях, отличающихся прежде всего степенью компактизации и транскрипционной активностью. Поддержание и изменение структуры хроматина является важнейшими факторами, влияющими на экспрессию генов, так как определяют степень доступности ре1уляторньтх элементов действию транскрипционных факторов. Одним из факторов, регулирующих организацию хроматина, является пространственное распределение хроматина в ядре клетки, в частности, взаимодействие хроматина с белками, ассоциированными с ядерной оболочкой. Также в формировании, раздельных функциональных доменов хроматина принимают участие регуляторные элементы, называемые иисуляторами. Одно из свойств инсулятора состоит в способности препятствовать распространению гетерохроматина на близлежащие эухроматииовые области. В клетке имеется ряд комплексов, способных изменять структуру хроматина и, таким образом, регулировать транскрипцию, к ним относятся и комплексы, осуществляющие различные химические модификации гистопов. В настоящее время, большое количество исследований посвящено изучению транскрипционных факторов и принципов их работы. Конечной целью является понимание работы молекулярного аппарата транскрипции. Ранее в нашей лаборатории был впервые описан новый коактиватор транскрипции эволюционно консервативный белок Еу2. Было предположено, что Еу2 вовлечен в регуляцию транскрипции большого числа генов в ходе развития дрозофилы. Было показано, что Еу2 коактивирует транскрипцию на хроматиновой матрице и входит в состав миогосубъединичиого комплекса, содержащего белок ТАЕ9. Целыо данной работы являлось изучение функций Еу2. Было показано, что Еу2 входит в состав БАСАЛТГС гистонацетилтрансфсразного комплекса дрозофилы, являясь новым, ранее не описанным компонентом этого комплекса. Хтаз2 и вместе с ним входит с состав нового ассоциированного с ядсрной порой комплекса, который участвует в организации экспорта мРНК. На модели кластера 8АСАТРТСзависимых генов теплового шока А мы показали, что Еу2 является белком, координирующим транскрипцию Ыр генов, их прикрепление к ЫРС и экспорт мРНК. Таким образом, впервые в многоклеточном организме был описан белок, осуществляющий физическую связь между транскрипцией генетического локуса, его внутриядерным положением и экспортом его транскриптов. Также впервые было показано, что Еу2 связывается с белком ЗиНу и является белковым компонентом 5иНзависимых инсуляторов МДГ4 и 1А2. Еу2 необходим для барьерной активности данных инсуляторов. Полученные результаты позволили предложить модель работы 8иНшзависимых инсуляторов как барьерных элементов. Таким образом, в данной работе сделан шаг в понимании функций инсуляторов и, следовательно, в развитие представлений о механизмах функциональной организации хроматина. В целом, проведенное исследование вносит вклад в понимание функций Еу2 и, следовательно, в общую картину организации экспрессии генов.

Название работы	Автор	Дата защиты
Котрансляционное сворачивание белка	Колб, Вячеслав Адамович	2002
Выделение и характеристика кор-частиц хроматина из плесневого гриба NEUROSPORA CRASSA	Ананьева, Наталия Михайловна	1985
Исследование полимеризации прионных белков дрожжей in vivo методом полуденатурирующего электрофореза	Александров, Илья Михайлович	2006

Электронная библиотека диссертаций

Поиск белков, взаимодействующих с новым транскрипционным фактором Е(у)2