Выделение и характеристика новых сериновых протеиназ растений

• Автор: Богачева, Анна Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил

Оглавление

Список сокращений.

Введение

1. Современные представления о сериновых протеиназах растений литературный обзор

1.1. Сериновые протеиназы.

1.1.1. Общие сведения о сериновых протеиназах.

1.1.2. Механизм катализа сериновых протеиназ.

1.2. Сериновые протеиназы растений.

1.2.2. Химотрипсины и АТФрегулируемые сериновые протеиназы растений.

1.2.3. Трипсины растений.

1.2.4. Субтилизины растений

1.2.5. Неклассифицированные сериновые протеиназы растений
1.3. Заключение
2. Материалы и методы
2.1. Материалы.
2.2. Методы
2.2.1. Выделение и очистка тараксализина.
2.2.2. Выделение предполагаемого природного субстрата тараксализина
2.2.3. Выделение и очистка плантаголизина
2.2.4. Обессоливание и концентрирование раствора фермента методом ультрафильтрации.
2.2.5. Определение белка по методу М. Бредфорд.
2.2.4. Определение активности ферментов по гидролизу синтетического хромогенного субстрата.
2.2.7. Определение активности ферментов по гидролизу белковых субстратов.
2.2.8. Определение субстратной специфичности по гидролизу Вцепи
окисленного бычьего инсулина.
2.2.9 Определение коллагенолитической акгивности плантаголизина
2.2 Выявление предполагаемого субстрата тараксализина
2.2 Определение зависимости активности ферментов от концентрации субстрата
2.2 Определение рНоптимума
2.2 Определение стабильности
2.2 Определение температурного оптимума фермента
2.2 Ингибиторный анализ.
2.2 Определение изоэлектричсской точки фермента методом изоэлсктрофокусирования.
2.2 ЭзКаПААГэлектрофорсз.
2.2 Определение молекулярной массы методом гельфильтрации на суттсрозе 6Я и в режиме РРЬС.
2.2 Определение молекулярной массы методом
ультрацентрифугирования.
2.2 Определение углеводного компонента
2.2 Определение аминокислотного состава фермента
2.2 Определение Ыконцевой последовательности фермента
2.2 Статистическая обработка результатов
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Выделение субтилизинов из корней одуванчика и листьев подорожника.
3.1.1. Выделение субтилизина из корней одуванчика тараксализина
3.1.2. Выделение субтилизина из листьев подорожника плантаголизина. .
3.2. Характеристика субтилизинов латекса корней одуванчика и листьев подорожника.
3.1.1. Энзиматические свойства тараксализина и плантаголизина.
3.1.2. Физикохимические свойства тараксализина и плантаголизина
3.3. Выделение и характеристика природного субстрата тараксализина
3.3.1. Выделение и характеристика субстрата тараксализина
3.3.2. Динамика накопления тараксализина в корнях в зависимости от физиологической фазы развития растения второго года жизни
3.4. Действие плантаголизина на коллаген.
3.5. Заключение
Выводы работы
Список цитируемой литературы


Анализ известных литературных источников показал, что протеиназьг обнаруживаются в большинстве вегетативных побегах, корнях и генеративных цветках, плодах, семенах органов растений, часто протеиназами богаты латексы растений. В результате предварительных опытов, проведенных в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова было установлено, что в латексе одуванчика содержится протеиназа, гидролизующая I синтетический субстрат субтилизиноподобных сериновых протеиназ. Настоящая работа посвящена изучению субтилизинов лекарственных растений тараксализина из латекса корней одуванчика лекарственного x ii . I. и плангаголизина из листьев подорожника большого I. Сериновые протеиназы. Общие сведения о сериновых протеиназах. Современная международная классификация ферментов КФ подразделяет ферменты в соответствии с типом катализируемых ими реакций. Исходя из этого, сериновые протеиназы относятся к амидгидролазам, то есть ферментам, расщепляющим амидные связи. Амидгидролазы разделяют на два подкласса протеазы ферменты, гидролизующие пептидные связи в белках и амидазы, гидролизующие все остальные амидные связи. Протеазы, в свою очередь, подразделяются на экзопептидазы собственно пептидазы и эндопептидазы протеиназы. Выделяют цистеиновые, сериновые и другие протеиназы. Схема классификации амидгидролаз показана на рис. Все сериновые протеиназы имеют каталитически активный серии, блокирование которого ведет к инактивации фермента. Активность сериновых прогеиназ подавляется специфическими ингибиторами, взаимодействующими с каталитически активным остатком серина ИГР, РМ5Г и некоторыми ингибиторами бактериального, растительного и животною происхождения. Следует отметить, что существуют количественные различия в действии тех или иных ингибиторов на разные ферменты этой группы. Многие сериновые протеиназы, чувствительные к О ГР, активны в присутствии РМБГ. Ряд сериновых протеиназ наряд с чувствительностью к ОН теряют каталитическую активность под действием реагентов на тиоловую группу РСМВ, Н С, то есть, являются тио л зависимыми. Амилазы 3. Протеазы 3. Циклоамидазы 3. Аминопелтидазы 3. Дипептидазы 3. Сериновые протеияазы 3. Дипептидилпептидазы 3. Цисте иновые протеиназы 3. Пептидилпептидазы 3. Асиартильныс протеиназы 3. Метаплокарбоксипептидазы 3. Рис. Схема классификации амидгидролаз. В скобках приведены номера по КФ1. Некоторые из этик ферментов построены из нескольких субьединиц с большой молекулярной массой 0 кДа. Большинство сериновых протеиназ гидролизуют пептидные связи предпочтительно в нейтральной или слабощелочной среде. Не вызывает сомнения важная роль сериновых протеиназ в процессах жизнедеятельности живых организмов. Эти ферменты широко распространены в природе, обеспечивают глубокое расщепление белков основу их катаболизма и целый ряд реакций ограниченного прогеолиза. Сериновые протеиназы принимают участие в процессинге предшественников биологически активных пептидов. Так, субтилизиноподобныс сериловые протеиназы животных фурин и его гомологи протеиназы и РСь расщепляют полипептидные цепи предшественников пептидных гормонов в местах расположения положительно заряженных аминокислотных остатков , 7. Субтилизиноподобный фермент, гомолог фурина из дрожжей протеиназа Кех 2 гидролизует пептидную связь последовательности , образуя феромон из его предшественника 8. Сериновые протеиназы участвуют в функционировании пищеварительной системы энтеропептидаза, трипсин, химотрипсии, в формировании неспецифического иммунитета протеиназы системы комплемента. Кроме того, эти ферменты участвуют в процессах свертывания крови тромбин, ппазмин, каллекреин. Известно несколько семейств, объединяющих эволюционно родственные сериновые протеиназы, характеризующиеся определенной пространственной структурой их полипептидных цепей и порядком расположения аминокислотных остатков каталитического центра.