Изучение эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, с помощью пептидных фаговых библиотек

• Автор: Туманова, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 148 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список принятых сокращений

Введение

Научная новизна и практическая ценность работы

Публикации и апробация работы

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Фаговый дисплей. История возникновения и области применения

1.2. Фаговый дисплей природных пептидов

1.2.1. Картирование эпитопов моноклональных и поликлональных антител

1.2.2. Получение иммуногенов И

1.3. Фаговый дисплей рандомизованных пептидов

1.3.1. Комбинаторные фаговые пептидные библиотеки
1.3.2. Картирование эпитопов природных антигенов и поиск их пептидных имитаторов
1.3.3. Идентификация пептидных лигандов
1.3.4. Определение субстратных последовательностей для протеаз
1.4. Пептиды, связывающиеся с антителами, и структурные основы пептидного узнавания
1.5. Увеличение эффективности отбора пептидов из фаговых пептидных библиотек
1.6. Заключение к п. 1.1 1.5
1.7. Вирус иммунодефицита человека первого типа
1.7.1. Строение внриона и молекулярная биология ВИЧ
1.7.2. Структура и функции комплекса поверхностных гликопротеинов
1.7.3. Сравнение зрелого олигомерного белка с вирусным дебрисом
1.7.4. Сравнение адаптированных Тклеточных вирусов и первичных нзолятов
1.7.5. Динамика гуморального иммунного ответа на ВИЧ1
1.7.6. Продукция нейтрапизующих антител к поверхностному
комплексу белков ВИЧ1
1.8. Эпитопы, узнаваемые нейтрализующими антителами
1.8.1. УЗэпитопы
1.8.2. Эпитопы Ссвязывающего домена 4
1.8.3. Синдуцируемые эпитопы 4i
1.8.4. Эпитопы У2петли
1.8.5. Эпитоп, узнаваемый МКА 2
1.8.6. Эпитоп, узнаваемый МКА 25
1.9. Механизмы нейтрализации
1 Значимость данных по нейтрализации ВИЧ1 ш vi .
1 Синергический эффект нейтрализующих ВИЧ1 антител
1 Заключение к п 1.71.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы
2.2. Ферменты
2.3. Изотопы
2.4. Олигонуклеотиды
2.5. Бактерии
2.6. Моноклональные антитела
2.7. Культуральные среды
2.8. Растворы
2.9. Растворы для нммуноферментного анализа
2 Фаговая пептидная библиотека
2 Методы
21. Бнотиншшрование моноклональных антител
22. Аффинная селекция
23. Приготовление ТВклеток Е.i штамм К Кап
24. Титрование фагов с использованием клеток, выращенных
на ТВсреде
25. Выделение и наработка индивидуальных фаговых клонов
26. Скрининг позитивных клонов
27. Выделение одноцепочечиой фаговой ДНК
28. Определение нуклеотидной последовательности фаговой ДНК
29. Иммунизация лабораторных животных
29.1. Иммунизация кроликов
29.2. Иммунизация мышей
2. Анализ сывороток иммунизированных животных
2. Постановка реакции нейтрализации ВИЧ1 i vi
Глава 3. Результаты
3.1. Аффинная селекция
3.2. Характеристика антигенных свойств отобранных клонов
3.3. Определение аминокислотного состава экспонируемых
пептидов и их общих структурных мотивов
3.4. Изучение отобранных пептидовимитаторов эпитопа белка
ВИЧ1, узнаваемого вируснейтрализующим антителом 25
3.4.1. Иммунизация лабораторных животных
3.4.2. Нейтрализация ВИЧ1 i vi
3.5. Локализация конформационного эпитопа гликопротеина ВИЧ1, узнаваемого вируснейтрализующим
моноклональным антителом 2
Глава 4. Обсуждение
Выводы
Список публикаций
Благодарности
Список литературы


I с геном минорного белка оболочки i бактериофага . i, . Из результатов этих первых экспериментов было сделано два важных вывода. ДНК. Ильичев и соавт. i i, vi . i,. i, . Спектр применения техники фагового дисплея для решения задач современной молекулярной биологии весьма широк. На поверхности фаговой частицы можно экспонировать рандомизованные и природные пептиды, белки и белковые домены, что позволяет использовать такие библиотеки для картирования эпитопов, узнаваемых моноклональными и поликлональными антителами получения пептидовимитаторов вирусных эпитопов и иммуногенов в целях разработки новых вакцин поиска пептидных лигандов для различных рецепторов и новых ингибиторов ферментов выделения высоко аффинных антител и исследования тонких механизмов белокбелковых взаимодействий. Традиционно эпитопное картирование проводится с помощью физикохимических методов 1 фрагментирование очищенного антигена протеазами i i, , определение взаимодействующих фрагментов и их секвенированис 2 химическое расщепление белков по конкретным аминокислотным остаткам i, i i, 3 химическая модификации определенных аминокислотных остатков антигена i, i . ЯМР и рентгеноструктурныи анализ. Фрагменты ДНК соответствующего антигена объединяют с геном, кодирующим капендиый белок i. Затем, из полученной таким образом фаговой библиотеки, экспонирующей белковые фрагменты, отбирают бактериофаги, специфично взаимодействующие с изучаемым антителом. Такая работа была успешно проделана для гена вируса иммунодефицита человека . V5 вируса синего языка . . . Ограничением в применении этого подхода, но сравнению с использованием комбинаторных пептидных библиотек подробнее см. Фаговый дисплей можно также использовать для получения иммуногенов. Короткие сегменты различных белков экспонировались на поверхности бактериофага М в целях получения гуморального иммунного ответа на поверхностные белки некоторых паразитов и вирусов. Например, тетрапептидные повторы антигена спорозоитов ii i i i, паразита, вызывающего у человека заболевание малярией, экспонировались на поверхности бактериофага и при иммунизации стимулировали наработку специфических антител . . Различные фрагменты некоторых белков оболочки ВИЧ1 экспонировались в целях получения вакцины . iv . V . Иммунный ответ на введенные вирусные частицы бактериофага М является Тзавнсимым и не нуждается в применении адъювантов ii . iv , . Комбинаторные фаговые пептидные библиотеки состоят из бактериофагов, экспонирующих на своей поверхности сотни миллионов разнообразных коротких ф аминокислотных последовательностей. М. Нитчатый бактериофаг напоминает собой гибкий стержень диаметром около 6. VIII примерно копий у бактериофага дикого типа. Внутри этой трубки находится одноцепочечная ДНК. Длина вириона зависит от размера заключенного генома. На одном конце вириона расположены пять копии каждого из минорных оболочечных белков i и VI, другие оболочечные белки VII и р1Х находятся на другом конце , i , . Каждая вариабельная аминокислота закодирована вырожденным кодоном или , где любой из четырех нуклеотидов, К или Т, или С. Все аминокислот и один сигнал терминации полипептндной цепи кодируются с помощью различных кодонов, представленных как или как . Для создания фаговой библиотеки олигонуклеотиды синтезируют с использованием конкретного нуклеотидного производного на позициях, кодирующих инвариантную последовательность и эквимолярной смеси необходимых дезоксннуклеотидтрифосфатов на тех позициях, где должна быть закодирована вариабельная аминокислота. Цепь, комплементарную олигонуклеотиду, можно синтезировать химически или ферментативно.