Клонирование и характеристика мРНК, содержащей повторяющийся элемент В2 и богато представленной в печени мыши

• Автор: Иванов, Павел Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 c. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Рассеянные повторяющиеся элементы.

генома эукариот.

Общая характеристика рассеянных повторяющихся эле

ментов

Длинные рассеянные повторы элементы с варьирующей. .

локализацией.

Короткие рассеянные повторы вездесущие последователь.

ности генома млекопитающих

Экспрессия рассеянных повторяющихся элементов.генома. . эукариот .

ЭКСПЕШМЕНТАЛЪНАЯ ЧАСТЬг

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .
1. Бактериальные штаммы и векторы для клонирова. ния
2. Получение полиАсодержащей мРНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха и печени мыши
3. Получение ядерной премРНК
4. Электрофоретическое фракционирование РНК.в агарозном геле и перенос на ДБМфильтры
5. Выделение ДНК плазмиды рВВ2 .
6. Получение библиотеки клонов кДНК на основе . . цитоплазматической полиСА печени мыши
7. Приготовление меченых тестпроб для гибрида
. зации .
8. Детектирование и отбор рекомбинантных клонов
Метод гибридизации с колониями
9. Выделение рекомбинантной ДНК
. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеа .
. зами
. Фракционирование ДНК с помощью электрофореза.
. Перенос ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозные фильтры блоттгибридизация
. Выделение вставочных фрагментов ДНК
. Концевое мечение.Р двуцепочечных.фраг.
ментов ДНК.
. Разделение цепей ДНК в ПААТ
. Выделение меченых дву и одноцепочечных . . фрагментов ДНК из ПААТ
. Определение первичной структуры ДНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Получение библиотеки клонов кДНК на основе цитоплазматической полиСАЭРНК печени мыши
и отбор рекомбинантов, содержащих повторы
В1 и В2
2. Рестрикционный анализ рекомбинантных клонов, содержащих последовательности, гомологичные Вэлементам определение.типа
клонированных Вэлементов
3. Анализ первичной структуры четырех клонированных к ДНК, содержащих повторяющийся элемент В2 полная копия В2последовательности представлена в одной из мажорных полиадени
. лированных мРНК печени мыши .
4 В2мРНКх основной тип В2содержащих мРНК печени мыши. Соседствование повтора В2 и уникальной слабоповторяющейся
. последовательности внутри транскрипта .
5. Универсальная ориентация повторяющихся последовательностей семейства В2 в поли
сомных и цитоплазматических полиАРНК
клеток асцитной карциномы и печени мыши
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ .
СШСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
мРНК матричная информационная РНК
премРНК ядерный предшественник мРНК
гяРНК гетерогенная ядерная РНК
дсРНК двуспиральная РНК
дсРНКА, В основные фракции дсРНК
к ДНК комплементарная ДНК, полученная путем
обратной транскрипции мРНК полиА, полиII гомополимерные участки молекул РНК
полиадениловая и полиуридиловая кислоты олиго А С, с1 гомополимерные участш молекул ДНК
полиАРНК РНК, содержащая полиА
В2РНК РНК, содержащая последовательность В
РП рассеянные повторы генома эукариот
КР, ДРП короткие и длинные рассеянные повторы
ОП повторяющиеся последовательностикопии,
имеющие обращенную ориентацию в геноме МДГ мобильные диспергированные гены
ДКП длинные концевые повторы МДГ
пвн. пар нуклеотидов
ПААТ полиакриламидный гель
ДСН додецилсульфат натрия
ДБМнфильтры диазобензилоксиметилированная бумага
раствор 0, М хлоритый натрий 0,5 М цитрат натрия, 7,
ВВЕДЕНИЕ


Рассеянные повторяющиеся последовательности ДНК РП, присутствующие в геномах практически всех эукариотических организмов, объединяют два основных типа повторяющихся элементов, различающихся по длине и относительному содержанию в геноме. Это короткие повторяющиеся последовательности КРП, длиной в несколько сотен п. ДРП, размер которых обычно составляет более 2 тыс. Относительное содержание РП обоих типов, а также характер их распределения варьирует в геномах разных организмов. Как правило, РП не являются точными копиями друг друга каждый тип включает многочисленные группы и семейства повторяющихся последовательностей, обособленные той или иной степенью внутригрупповой гомологии. Количество семейств РП варьирует в очень широком диапазоне и не коррелирует со сложностью организма. Так, в геноме быка и ряда грибов присутствует менее ти семейств рассеянных повторов, в то время как у многих других эукариот число семейств достигает десятков и даже сотен тысяч дат. Члены одного семейства РП обычно не соседствуют друг с другом и диспергированы в геноме среди повторов других семейств и уникальных элементов . Фракции КРП и ДРП после реассоциации характеризуются неодинаковой термостабильностью длинные более высокой, а короткие более низкой, что говорит о значительно большей дивергенции последовательностей, составляющих семейства КРП, чем ДРП . Анализ клонированных повторяющихся участков генома некоторых видов морского ежа , подтверждает данную точку зрения и указывает на то, что длинные повторяющиеся последовательности могут состоять из коротких. Одним из примеров таких сложных повторяющихся элементов являются так называемые перетасованные зсгаУнЫеЛ последовательности достаточно протяженные повторы, состоящие из отдельных коротких субэлементов ,1,7. Последовательности этого семейства представляют собой определенные, но различные в каждом конкретном случае сочетания из одного и того же набора коротких повторов. Некоторые из этих коротких повторов, выполняющих роль внутренних дискретных участков гомологии перетасованных последовательностей существуют в геноме также и самостоятельно в виде отдельных диспергированных копий 1 С другой стороны в ДНК морского ежа 3. РП составляет лишь ,, что указывает на то, что в геноме эукариот существуют длинные и короткие РП, не имеющие взаимной гомологии и соседствующие с уникальными последовательностями. Заметные успехи в изучении РП были достигнуты с введением в исследовательскую практику методов генной инженерии. С помощью клонирования ДНК выделены и детально охарактеризованы многие индивидуальные семейства РП. Выяснилось, что различные копии одного семейства отличаются друг от друга не только за счет нуклеотидных замен, но и за счет инсерций, делеций и транслокаций. Примером такого избирательного расположения повторов служит одно из семейств РП человека с частотой повторяемости приблизительно 0 ИЗ. Это семейство встречается только в определенных районах хромосомы, где перемежается с другим повторяющимися последовательностями. Расположение в геноме по крайней мере части РП строго не фиксировано и может меняться в фило и онтогенезе. Такие последовательности получили название генетических элементов с нестабильной локализацией ,,3. Подобные мобильные элементы, имеющие сходство с бактериальными транспозонами и I элементами обнаружены у одноклеточных эукариот и высокоразвитых многоклеточных организмов см. В настоящее время высказывается мнение, что большинство эффективно транскрибирующихся РП относится к мобильным генетическим элементам, которые, повидимому, являются важной общей структурной деталью всех эукариотических организмов 8. Существуют предположения об участии этих элементов в процессах, связанных с репликацией и реорганизацией генома, регуляцией экспрессии генов, канцерогенезом. Они могут играть роль в определении ряда количественных характеристик, например,имеющих отношение к жизнеспособности индивидуумов . Члены многих семейств РП, как коротких, так и длинных встречаются в геноме в виде копий, имеющих взаимопротивоположную ориентацию . Совокупность таких обращенных или инвертированных повторов 0П составляет чрезвычайно быстро ренатурирующую фракцию ДНК при i I 0.