Структура и функции С-концевого домена тропомодулина, белка, кэпирующего актиновые филаменты

• Автор: Кригер, Инна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил

Содержание

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Актиновые филаменты и актинсвязывающие белки, контролирующие динамику актина в клетке.

1.2 Регуляция длины актиновых филаментов

1.3 Тропомодулин белок, кэпирующий актиновые филаменты на медленно растущем конце

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Экспрессия и выделение тропомодулина Тто1

2.2 Получение и очистка Сконцевого фрагмента тропомодулина С.

2.3 Получение и очистка Ыконцевого фрагмента тропомодулина Ы.

2.4 Получение и очистка концевого фрагмента небулина М1М2МЗ.
2.5 Сшивание глутаровым альдегидом
2.6 Биотинилирование тропомодулина и С
2.7 Дотэкспсримснты по связыванию биогинилированного тропомодулина или С.
2.8 Кристаллизация Си сбор дифракционных данных.
2.9 Решение и уточнение структуры С.
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Выделение и очистка белков.
3.2 Взаимодействие тропомодулина с тропомиозином, актином и небулином
3.3 Кристаллизация С
3.4 Сбор рентгеноструктурных данных.
3.5 Построение и уточнение атомной модели С.
3.6 Описание структуры Сконцевой половины тропомодулина С
3.7 как новый для актинсвязмвакмцих белков способ укладки полипептидной цепи и его возможный вклад в копирование медленно растущего конца актиновыч филаментов
3.8 Возможный механизм копирования медленно растущего конца актиновых филаментов тропо.модулином
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Актиновый филамент полярен, так что его концы быстро растущий и медленно растущий отличаются друг от друга, как по структурным, так и по динамическим характеристикам. Тропомодулин кДа специфически связывается с медленно растущим концом актиновых филаментов, подавляя дальнейший рост или диссоциацию филамента на этом конце, и таким образом принимает участие в определении и регуляции длины актиновых филаментов в клетках. Тропомодулин встречается в большинстве типов клеток млекопитающих. На данный момент описано четыре изоформы тропомодулина, два более крупных родственных белка кДа, названых лейомодинами. у i, отвечающий за асимметричное деление клеток. На медленно растущем конце актиновых филаментов тропомодулин взаимодействует с тропомиознном, актином и, если есть, небулином. В отсутствие тропомиозина сродство тропомодулина к медленно растущему концу актиновых филаментов мало, тогда как в присутствии тропомиозина это сродство возрастает больше чем в раз. Кэпирующую активность приписывают Сконцевой половине тропомодулина. консц тропомодулина взаимодействует с концом тропомиозина, предположительно образуя тройную скрученную спираль. Установлено, что тропомодулин также способен взаимодействовать с концевым фрагментом небулнна модулями I. Для понимания механизма кэпирования медленно растущего конца тропомодулином очень важной представляется информация о структуре этого белка. До недавнего времени, пока в нашей лаборатории не были проанализированы данные малоуглового рентгеновского рассеяния, даже форма молекулы была спорным вопросом. В настоящей работе представлена атомная структура Сконцевой половины тропомодулина. Эта часть молекулы была выбрана в качестве объекта структурных исследований изза ее основной роли в собственно копировании, а также по причине ее компактности, показанной в предшествующих исследованиях методами ограниченного протсолиза и калориметрии. Исследования, проделанные в нашей лаборатории, показали, что Сконцевая и концевая половины тропомодулина различаются как структурно, так и функционально. концевая половина вытянута и в растворе не имеет определенной третичной структуры, но, очевидно, структурируется при связывании с тропомиозином. Тогда как Сконцевая половина представляет собой компактно свернутый домен, устойчивый к протеолизу и плавящийся кооперативно. Атомная структура Сконцевой половины тропомодулина С содержит лейцин богатые повторы ii или , имеющие характерную соленоидную упаковку. Основываясь на функциональных экспериментах и на информации из литературы о способах функционирования белков, мы предлагаем возможный механизм кэпирования тропомодулином медленно растущего конца актиновых филаментов. Актиновые филаменты и акгинсвязывающие белки, контролирующие динамику актина в клетке. Функции актина можно подразделить на две группы те, которые выполняются стабильными актнновыми филаментами, и те, которые зависят от непрерывной сборкиразборки мономеров в полимер. Стабильные актиновыс филаменты принимают участие в сокращениях, производимых скользящими филаментами в мышцах, стрессовыми волокнами или во время транспорта органелл V ii, . Также сеть из стабильных актиновых филаментов служит подстилающим скелетом клеточных мембран x, , а сшитые в прочные пучки они являются внутренней основой микроворсинок x, , i . С другой стороны, клеточная подвижность, связанная с образованием ламеллоподий, или подвижность бактерий внутри клетокхозяев зависит от динамики актина ii , , i vii, . Актиновые мономеры кДа, гак называемый актин, при концентрации выше критической способны полимеризоваться, образуя длинные спиральнозакрученные филаменты актин, как i vi, так и i viv рис. . Актиновые филаменты полярны, так же как и актиновые мономеры, из которых они сформированы, как в структурном, так и в функциональном отношении. Оба конца быстро растущий иди тупой и медленно растущий или острый способны принимать и терять мономеры. Но предпочтительней полимеризация происходит с быстро растущего конца.