Белковые молекулы в состоянии "расплавленной глобулы"

• Автор: Долгих, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 189 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Равновесные и кинетические исследования денатурации и ренатурации белков

2.1. Основные определения .

2.2. Равновесные состояния белков в различных денатурирующих условиях.

2.2.1. Денатурация гуанидинхлорвдом.

2.2.2. Денатурация другими солями гуанидина.

2.2.3. Денатурация мочевиной

2.2.4. Температурноденатурированное состояние .

2.2.5. Денатурация изменением .

2.2.6. Денатурация неорганическими солями .

2.2.7. Другие типы денатурации
2.3. Промежуточные состояния на пути денатурации и ренатурации белков.
2.3.1. Равновесные исследования .
2.3.2. Кинетические исследования
2.4. Объекты исследования
2.4.1. Коровий олактальбумин.
2.4.2. Человеческий облактальбумин
2.4.3. Карбоангидраза В
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Выделение и очистка препаратов .
3.1.1. Коровий оСлакталъбумин.
3.1.2. Человеческий олакталъбумин .
3.1.3. Карбоангидраза В .
3.2. Приготовление растворов
3.3. Методы исследования
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Промежуточные формы коровьего облакталъбумина
4.1.1. Кислая форма.
4.1.2. Температурноденатурированная форма
4.2. Промежуточные формы человеческого оСлактальбумина
4.3. Роль кальция в структуре облактальбуминов
4.4. Промежуточные формы карбоангидразы В
4.4.1. Кислая форма.
4.4.2. Промежуточная по гуанидинхлориду форма
4.5. Состояние расплавленной глобулы как особое физическое состояние белковой молекулы
4.5.1. Физическая природа состояния расплавленной глобулы
4.5.2. Фазовые переходы между нативным состоянием и состоянием расплавленной глобулы
4.5.3. Физические критерии нативности глобулярного белка
4.6. Кинетические исследования карбоангидразы В. Роль состояния расплавленной глобулы в самоорганизации
4.6.1. Кинетика ренатурации карбоангидразы В из развернутого состояния
4.6.2. Кинетика ренатурации карбоангидразы В из состояния расплавленной глобулы
4.6.3. Лежит ли состояние расплавленной глобулы на прямом пути сворачивания .
5. ЗАКЯШЕНИЕ.
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Систематическое исследование состояния белков в концентрированных обычно 6 М растворах гуанидинхлорида началось в середине х гг. Тэнфорда с сотрудниками. Прежде всего было показано, что для ряда белков без ББ связей или с разорванными меркаптоэтанолом дисульфидами связями в 6 М ГХЛ оказываются справедливыми соотношения зависимости характеристической вязкости и константы седиментации от длины пслипептидной цепи, характерные для полимеров в состоянии статистического клубка. Величина показателя степени при п близка к аналогичному показателю для статистических полимерных клубков . М, а, возможно, и более низких концентрациях гуанидинхлорида. Кроме того, в других лабораториях были получены аналогичные результаты, свидетельствующие о справедливости соотношения I и для ряда других белков , . Ц парциальный удельный объем белка и плотность раствора. Показатель степени 0, при п в уравнении 2 также характерен для статистических клубков . Таким образом, поведение белков без дисульфидных связей или с разорванными связями в концентрированных растворах ГХЛ по своим гидродинамическим характеристикам, а именно, характеристической вязкости и константе седиментации, хорошо соответствует поведению полимерных цепей в состоянии статистического клубка, детально исследованному теоретически и экспериментально в физической химии полимеров. Состояние белков в концентрированных растворах гуанидинхлорида хорошо изучено также оптическими методами. З о от да. Л о 2 нм. В данном случае, однако,нельзя утверждать, что вторичная структура рассмотренных белков в концентрированных растворах ГХЛ соответствует статистическому клубку только на основании параметра ьо, т. Поэтому Тэнфордом также был проведен расчет величины оптического вращения для ряда белков без дисульфидных связей в 6 М ГХЛ на основе известного аминокислотного состава и величин т для отдельных аминокислот, полученных из данных по модельным пептидным соединениям с учетом различного вклада концевых и внутренних аминокислот. Рассчитанные величины оптических вращений денатурированных белков для трех длин волн 0, 0 и 9 нм оказались близки к экспериментальным значениям, что говорит об отсутствии оптических эффектов, связанных с регулярным взаимным расположением аминокислотных остатков. Эти результаты, как и данные гидродинамических методов, также свидетельствуют в пользу клубкообразной конформации белков в концентрированных растворах ГХЛ. Исследование ряда белков без дисульфидных связей в 6 М гуанидинхлориде методом кругового дихроизма, проведенное в работе , показало, что особенности спектров кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области, хорошо выраженные в нативных белках, полностью исчезают в 6 М ГХЛ типичный спектр развернутого ГХЛ белка характеризуется небольшой отрицательной эллиптичностью в районе 00 нм и завалом в области 00 нм. Правда, спектры 9 исследованных белков в 6 I ГХЛ совпадают не полностью удельная эллиптичность при 0 нм колеблется в пределах 123 градсм2дмоль. Спектры, подобные приведенным в работе , были получены и для других белков в 6 М ГХЛ , . В ближней ультрафиолетовой области спектрн белков в 6 М ГХЛ практически полностью отсутствуют , что свидетельствует о симметричном окружении ароматических боковых груш в этих условиях, и, таким образом, подтверждает отсутствие жесткой структуры белка вблизи ароматических груш. Детальная информация о поведении белков в 6 М гуанидинхлориде а также процессах денатурации и ренатурации см. ЯМР, который позволяет судить о состоянии отдельных аминокислотных остатков в белке и даже всех остатков при хорошем разрешении. Первое систематическое исследование в этой области было проведено в году Брэдбэри и Кингом , которые показали, что при денатурации 6 М ГХЛ для белков с интактными дисульфидными связями из II исследованных ширина линий метильных резонансов лейцина, изолейцина и валина постоянна и не зависит от молекулярного веса белка. Эго свидетельствует об одинаковом окружении метильных груш белков в 6 М ГХЛ, что соответствует отсутствию какойлибо остаточной структуры.