Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II C-белками

• Автор: Богданова, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 98 с. : ил.

1.1 .Явление рестрикциимодификации

1.2. Системы рестрикциимодификации типа I

1.3. Системы рестрикциимодификации типа II

1.4. Системы рестрикциимодификации подтипа 1Ю

1.5. Системы рестрикциимодификации типа III

1.6. Распространение систем рестрикциимодификации

1.7. Молекулярная организация систем рестрикциимодификации

1.8. Регуляция экспрессии генов в системах РМ типа I и III

1.9. Регуляция экспрессии генов в системах РМ типа II

1.9.1.Регуляция экспрессии генов СРМ за счет действия ДНКмстилтрансфераз

1.9.1.а. Регуляция экспрессии генов за счет ковалентной модификации промоторных элементов
1.9.1.6. ДНКметилтрансфераза авторегулятор собственного синтеза
1.9.2. Регуляция на пост транскрипционном уровне
1.9.3. Регуляция экспрессии генов СРМ Сбелками
1.9.3.а. Структурная организация генов СРМ типа II, контролируемых Сбелками организация Сбоксов.
1.9.3.6. Механизмы регуляции генов СРМ типа II Сбелками.
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
.1 Материалы и реактивы
И. 1.1. Штаммы бактерий и плазмидные вектора
II. 1.2. Среды и основные буферы
.1.3. Материалы и реактивы
.2. Методы исследования
.2.1. Выделение плазмидной ДНК
И.2.2. Получение препарата фага Хуц в высоком титре
.2.3. Получение компетентных клеток Е.соИ и их трансформация
.2.4. ПЦРамплификация ДНК
.2.5. Препаративное выделение фрагментов ДНК
2.6. Метод задержки в геле комплексов ДНКбелок
II.2.7. Определение транскрипционной активности промоторов
.2.8.1. Защита ДНК от расщепления ДНказой I
.2.8.2. Перманганнатная проба.
И.2.9. Выделение тотальной РНК и реакция удлинения праймера
.2 Определение и анализ первичной последовательности ДНК
.2 Электрофорез в полиакриламидном и агарозном гелях
.2 Определение активности галактокиназы
.2 Определение Р галактозидазы
.2 Проведение реакций модификации ДНК
.2 Плазмидные конструкции
.2 Экспрессия и очистка белков
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1. Регуляция СРМ
III. 1.1. Анализ первичной последовательности структуры генов I
и .
1.1.2. Экспрессия генов СРМ i viv.
III. 1.3. Взаимодействие регуляторного белка С. с операторным
участком Сбокс.
III. 1.4. Сбслок регулирует транскрипцию i vi с промотора гена ЭР
Р .
III. 1.5. Активность промотора гена I зависит от модификации
уникального сайта .
II1.2. Регуляция СРМ типа II 1.
1.2.1. Анализ первичной последовательности структуры генов I6I 6I и 1И.
1.2.2. Экспрессия генов СРМ типа II 6 i viv.
1.2.3. Клонирование гена 6I и очистка рекомбинантного белка . 1.
1.2.4. Определение участка связывания для регуляторного белка 6i6I.
1.2.5. Взаимодействие регуляторного белка .6I с промоторно операторными участками.
1.2.6. .6I позитивно регулирует транскрипцию гена 1 i vi.
I.2.7. Дополнительный механизм регуляции
III.2.8. .6I негативно регулирует транскрипцию гена 6I
i vi.
Ш.З. Регуляция СРМ типа II V.
1.3.1. Анализ первичной последовательности структуры генов СРМ типа II V.
1.3.2. Для полноценной работы генов СРМ V необходим продукт малой ОРС.
1.3.3. Влияние С.V на экспрессию генов СРМ V i viv.
1.3.4. Взаимодействие регуляторного белка .V с Сбоксом.
Ш.З.5. Влияние .V на транскрипцию с промоторов генов СРМ
V i vi.
Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Структурная организация генов СРМ типа II, контролируемых Сбелками организация Сбоксов. Механизмы регуляции генов СРМ типа II Сбелками. II. И. 1. II. И.2. Получение компетентных клеток Е. II. Перманганнатная проба. И.2. III. III. III. Экспрессия генов СРМ i viv. III. Взаимодействие регуляторного белка С. Сбокс. III. Р . III. II1. Регуляция СРМ типа II 1. Анализ первичной последовательности структуры генов I6I 6I и 1И. Экспрессия генов СРМ типа II 6 i viv. Клонирование гена 6I и очистка рекомбинантного белка . Определение участка связывания для регуляторного белка 6i6I. Взаимодействие регуляторного белка . I с промоторно операторными участками. I позитивно регулирует транскрипцию гена 1 i vi. I.2. III. Ш.З. Регуляция СРМ типа II V. Анализ первичной последовательности структуры генов СРМ типа II V. Для полноценной работы генов СРМ V необходим продукт малой ОРС. Влияние С. V на экспрессию генов СРМ V i viv. Взаимодействие регуляторного белка . V с Сбоксом. Ш.З. Влияние . V i vi. СРМ система рестрикциимодификации Трис трисгидроксиметиламинометан т. Системы рестрикциимодификации СРМ широко распространены среди различных микроорганизмов. К настоящему времени обнаружено и охарактеризовано свыше СРМ у различных видов бактерий и археобактерий . Системы рестрикциимодификации II типа состоят из двух основных генов, которые кодируют ферменты, узнающие одну и ту же последовательность ДНК эндонуклеазу рестрикции ЭР и ДНКметилтрансферазу МТ. Эндонуклеаза рестрикции катализирует разрыв фосфодиэфирной связи по обеим цепям ДНК в модифицированном сайте узнавания. Метилирование цитозиновых или адсниновых оснований в сайте узнавания ДНКметилтрансферазой с образованием полуметилированного или полностью метилированного сайта защищает ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой. Для некоторых СРМ типа II, например, ВатШ, v, ссЮ и V было показано наличие дополнительного гена, кодирующего короткий регуляторный белок С Iv . Большинство изученных СРМ ведут себя, как эгоистические мобильные генетические элементы, приводящие к иостсегрегационной гибели клетки i, . ЭР после потери защиты, обусловленной действием . Таким образом, СРМ действуют как системы токсинантитоксин, также называемые аддиктивными модулями. При этом роль долгоживущего токсина выполняет ЭР, а антитоксином, защитное действие которого ограничено во времени, является МТ. По мнению , и i и др. СРМ также принимают участие в инициации рекомбинации ДНК клеткихозяина. Большинство генов СРМ локализованы на плазмидах, которые способны перемещаться как в клетки того же вида, что и бактерияхозяин, но не имеющие плазмиды СРМ, так и в бактерии других видов i , i . Очевидно, что в момент попадания плазмиды, несущей гены СРМ, в наивную клетку, не имеющую такой системы, синтез ЭР и МТ должен быть координирован. ЭР или недостаточной продукции МТ. Вместе с хозяином погибнет и плазмида с генами рестрикциимодификации исход явно нежелательный с точки зрения эгоистического генетического элемента.