Разработка молекулярных маркеров для эпидемиологического анализа клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis

• Автор: Лихошвай, Екатерина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Иркутск, Нью-Джерси
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика микобактерий.

1.2. Молекулярнобиологические методы, используемые в эпидемиологических исследованиях возбудителей туберкулеза.
1.3. Анализ филогенетических взаимоотношений среди представителей комплекса микобактерий туберкулеза

1.4. Характеристика эпидемиологически значимой

группы микобактерий ii

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микобактерий, используемые в исследовании.

2.2. Выделение ДНК из культур микобактерий.

2.3. Праймеры, используемые для ПЦР амплификации и секвенирования.
2.4. Приготовление гибридизационных зондов.
2.5. Реактивы для гибридизации по Саузерну.
2.6. Методика гибридизации
2.7. Секвенированис фрагментов ДНК.
2.8. Методика гибридизации с молекулярными бикэнами ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ БЫСТРОЙ
ИДЕНТИФИКАЦИИ II ШТАММОВ
3.1. Анализ результатов гибридизации клинических
штаммов с ii зондом
3.1.1. межгенный район хромосомы
микобактерий.
3.1.2. область хромосомы . i
3.1.3. Хромосомный локус , регион В.
3.2. Интерпретация результатов гибридизации с
многокомпонентным Vii зондом.
ГЛАВА 4. АНАЛИЗ ХРОМОСОМНЫХ ДЕЛЕЦИЙ 1, 6, 1 КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ М I.
4.1. Гибридизация хромосомных ДНК с зондом .
4.2. Гибридизация с 6 зондом
4.3. Гибридизация с зондами 1.
ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЛЕЦИЙ, СПЕЦИФИЧНЫХ
ДЛЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ II ГРУППЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В качестве наиболее перспективных, следует выделить молекулярнобиологические методы, особенно комплексное сочетание нескольких методов, что позволит более точно выявлять звенья эпидемиологических цепочек распространения инфекции и своевременно локализовать очаги туберкулеза. Особенности природы заболевания, в частности длительность инкубационного периода, лекарственная устойчивость и отсутствие надежных методов идентификации штаммов возбудителя затрудняют диагностику и лечение туберкулеза, а также эпидемиологические исследования в очагах. Последние достижения молекулярной биологии в сочетании с успехами в области молекулярной генетики микобактерий позволили разработать способы надежной дифференцировки штаммов i i М. Однако подавляющее большинство методов, используемых для молекулярного типирования туберкулеза, отличается многоступенчатостью проведения, недостаточной дискриминативной способностью, высокой стоимостью. Проведение исследований, направленных на поиск молекулярных маркеров специфичных для отдельных эпидемиологически значимых групп микобактерий, особенно имеющих лекарственную устойчивость, и разработка простых в исполнении, точных и недорогих методов идентификации групп штаммов М. Целью исследования являлась разработка молекулярных маркеров и оптимизация методик их использования для идентификации отдельных групп особо вирулентных штаммов М. ii филогенетической линии, среди клинических изолятов микобактерий. Используя данные ранее проводимых исследований, разработать одноэтапный метод для идентификации Vii штаммов среди клинических изолятов М. IТВС клинических штаммов М. Разработать молекулярные маркеры, специфичные для интактного и измененного, в связи с микроделецией, фрагмента гена 1, отвечающего за продукцию фенолгликолипидов факторов вирулентности М. с зондами . Разработать гибридизационные зонды, специфичные для фрагментов , 6, 1. Провести анализ делеций , 6, 1 с использованием ПЦР амплификации, гибридизации и метода с зондами клинических изолятов М. Провести исследование, базирующееся на секвенировании фланкирующих последовательностей различных по локализации и размеру делеций, представленных в геноме для дифференциации различных кластеров ii штаммов, а также представителей других филогенетических линий М. На сегодняшний день в литературных источниках описано множество молекулярнобиологических методов для генотипирования штаммов М. ДНК анализ. Учитывая особенности некоторых эпидемиологически значимых групп возбудителей, таких как ii штаммы широкую распространенность, высокий уровень смертности при заражении данными штаммами и часто встречающуюся лекарственную устойчивость, идентификация изолятов ii филогенетической линии имеет большое практическое значение. Только единичные лаборатории имеют возможность применения нескольких методов генотипирования в виду высокой стоимости проведения исследований. Проведение типирования с использованием нескольких методов занимает в лучшем случае 5 дней. Больной с активной формой туберкулеза способен заразить в течение месяца от до 0 человек. Исходя из этого, возникает необходимость в разработке быстрого недорогого и эффективного метода, способного определить микобактерии, принадлежащие к ii группе. В настоящем исследовании впервые разработан метод генотипирования штаммов ii, с применением техники гибридизации, основанный на комплексном использовании нескольких специфичных апробированных маркеров. Метод высокочувствительный, быстрый и удобный для выделения различных групп представителей ii, в том числе обладающих лекарственной устойчивостью среди любых штаммов микобактерий. Проведен анализ хромосомных делений , 6, 5 при сопоставлении результатов с данными I6 типирования у анализируемых клинических штаммов М. Впервые описан 160 кластерный состав предковой не имеющих дслецию группы штаммов. Показано распределение исследуемых штаммов по выявленным и ранее известным признакам.