Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра

• Автор: Мишин, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Флуоресцентный белок v и его свойства

I.i. 1. Аминокислотные замены, влияющие на экспрессию v

1.1.2. v дикого типа и другие его варианты с прогонированным хромофором

1.1.3. Варианты v с анионным хромофором

1.1.4. Варианты v с флуоресценцией в синей и голубой i областях спектра

1.1.5. Варианты v с флуоресценцией в желтой области спектра

1.1.6.Фотоконверсия в бескислородных условиях

I.II Флуоресцентные белки с хромофором, отличающимся от
11. Красный флуоресцентный белок и его варианты
12. Флуоресцентные белки с подобным предшественником хромофора.
13 Красный фотоактивпруемый флуоресцентный белок
I.1 II. Функциональное значение, эволюция и разнообразие
подобных белков
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II. 1. Материалы и оборудование
.2. Методы исследования
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1.1. Получение варианта v с флуоресценцией в красной области спектра
III.I.. Варианты v и vV
III.I.2. Случайный мутагенез вариантов v и vV
1.1.3. Характеристика вариантов v I, 2, 3,
IIIЛ.4. Получение варианта v с пиком эмиссии флуоресценции в красной области спектра ШЛ.5. Случайный мутагенез 51 с отбором по времени появления и интенсивности красной флуоресценции. Варианты 6 и 3
III.II. Вариант 3 и его свойства
III1. Спектральные свойства
III.II.2. рНзависимость флуоресценции варианта
13. Температурная зависимость и кинетика функционального созревания
14. Использование 3 в качестве двухцветной метки
15. Анализ аминокислотных замен в варианте
16. Предлагаемый механизм образования хромофора в варианте
17. Эффективность образования хромофора с красной флуоресценцией в полученных вариантах v
III.III.Исследование фотоконверсии в анаэробных условиях
III.III. 1. Спектральные свойства фотокоивертированной формы .
1.1.2. Исследование способности различных флуоресцентных белков к фотоконверсии в бескислородных условиях
12. Исследование фотоконверсии флуоресцентных белков в присутствии дитионита натрия
ШЛ1.4. Анализ аминокислотных последовательностей флуоресцентных белков, способных к фотоконверсии в бескислородных условиях ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При этом единственное описанное состояние аувРР, в котором этот белок проявляет способность к красной флуоресценции, при фотоактивации под действием интенсивного облучения синим светом в условиях пониженного содержания кислорода , , остается практически не изученным и нашло только ограниченное применение в экспериментах с анаэробными организмами. До настоящего времени не найдено объяснения необычному характеру спектра эмиссии флуоресценции аувРР при такой фотоактивации, чувствительности процесса к содержанию кислорода, и не предложено гипотез, объясняющих механизм данного явления. Целью данной работы стало получение вариантов ауСРР, способных к флуоресценции в красной области спектра, с применением современных данных о механизме образования хромофоров красных флуоресцентных белков, и исследование фотоконверсии аувРР и некоторых других ФБ в бескислородных условиях. ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В первой части обзора литературы рассматриваются общие характеристики СЕР, его структура, биохимические и спектральные свойства. Рассмотрены опубликованные ранее варианты этого флуоресцентного белка, современные данные о структурнохимической роли ключевых аминокислотных замен, определяющих спектральные характеристики. Вторая часть обзора посвящена анализу свойств и механизмов образования хромофоров других флуоресцентных белков, прежде всего, флуоресцирующих в красной области спектра. В заключение кратко рассмотрены современные представления о функциональном значении и эволюции СЕРподобных белков. РР синоним агСЕР небольшой глобулярный белок с молекулярной массой в соответствии с данными массспектрометрии 6. Да , 7, состоящий из 8 а. Хромофор СЕР, обуславливающий его зеленую флуоресценцию при облучении УФ, представляет собой 4ргидроксибензиледенимидазолин5он с цисгеометрией и формируется тремя последовательно расположенными аминокислотными остатками, претерпевающими посттрансляционные модификации циклизацию и окисление серином в положении , тирозином в положении и глицином в положении рис. В растворе, при концентрациях менее 1 мгмл, СЕР и большинство его мутантов представляют собой мономеры. Склонность к образованию димеров проявляется у аЕР и большинства его мутантов только при высоких концентрациях белка, используемых при кристаллизации, что выделяет его в ряду прочих флуоресцентных белков и является одним из самых существенных достоинств. СЕР в нормальных условиях принимает форму рбочонка рис. Внешнюю поверхность цилиндра формируют регулярно расположенных 3слоев, торцы закрыты относительно короткими спиральными участками , 7 . При этом спиральный участок в центре из аминокислотных остатков остатки , в том числе хромофоробразуюшая триада , содержит всего лишь три водородные связи в основной пептидной цепи аспираль, спираль, 30спираль , 7, 9, при этом остатки оказываются в конформации, благоприятствующей образованию хромофора. Предполагается, что автокаталитический процесс образования хромофора проходит в два этапа, происходящих почти сразу после сворачивания и принятия нм нативной конформации. Первый этап быстрая циклизация между серином в положении и глицином в положении за счет нуклеофильной атаки амидного азота глина на карбонильный атом углерода остатка , с образованием, после дегидратации, имидазолидона рис. По данным исследования образования хромофора при ренатурации из телец включения, характеристическое время этого процесса составляет порядка 3 мин 9. Второй этап окисление боковой цепи тирозина в положении молекулярным кислородом, в результате чего ароматическое кольцо входит в сопряжение с имидазолидоном. Второй этап проходит существенно медленнее, лимитирует общее время функционального созревания белка , и занимает около мин при нормальных аэробных условиях с концентрацией кислорода около 0 мкМ 9. Образование хромофора термочувствительный процесс при увеличении температуры его эффективность значительно снижается . Мутагенез и кристаллографические исследования выявили некоторые консервативные аминокислотные остатки, так или иначе вовлеченные в процесс образования хромофора, среди них следует отметить наиболее консервативные для всех известных флуоресцентных белков и 2 , , .