Изучение особенностей пролиферации эмбрилнальных клеток японских ускоренно стареющих мышей (SAM)

• Автор: Семенова, Ирина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил

Введение

Обзор литературы

1. Клеточный цикл

1.1 .Состояние пролиферативного покоя

1.2. Факторы роста

1.3. Активация тирозинкиназных рецепторов факторами роста

2. Проблема концевой недорепликации

2.1. Пролиферация клеток i vi. Ограничение пролиферативного

потенциала клеток многоклеточных организмов

2.2. Теломериая теория старения, или теория маргинотомии А. Оловиикова

2.3. Экспериментальные подтверждения теории А.М. Оловникова

3. Теломеры
3.1. Теломерный повтор
3.2. Функции тсломер
4. Теломераза ,
4.1. РНК компонент теломеразы
4.2. Теломеразные белки
4.3. Работа теломеразы
4.4. Механизм образования 3 одноценочечного фрагмента
4.5. Экзонуклеазная активность теломераз
4.6. Альтернативные механизмы поддержания длины теломер
4.7. Ингибиторы обратных транскриптаз нуклеотидной природы
5. Пролиферация клеток различных видов в культуре
5.1. Морфологические стадии старения фибробластов в культуре
5.2. Фибробласты человека в культуре
5.3. Старение, или I
5.4. Состояние кризиса, или М2
5.5. Клетки мыши в культуре
6. Ускоренно стареющие мыши линий и
7. Связь между старением клеток в куль туре и естественным старением
организма
7.1. Корреляция пролиферативного потенциала клеток с видовой продолжительностью жизни
7.2. Зависимость пролиферативного потенциала фибробластов от возраста донора
7.3. Низкий пролиферативный потенциал фибробластов при наследственных болезнях преждевременного старения прогериях
7.4. Данные об ограниченности потенциала клеточных делений i viv
Материалы и методы
1. Животные линий 1, 1, СВ А
2. Получение животных с датированной беременностью
3. Получение эмбриончьных фибробластов мыши
4. Условия культивирования клеток
5. Замораживание клеточных культур
6. Размораживание клеточных культур
7. Культивирование клеток в присутствии перекиси водорода
8. Выявление активности эндогенной 3галакгозидазы рП6.0
9. Пролиферативный покой и стимуляция ростовыми факторами
. Радиоавтография
. Исследование фосфорилирования тирозина
. Определение теломеразной активности ТАК
. Ингибиторы обратных транскриптаз
. Изучение теломер
. Гибридизация i i
. Приготовление хромосомных препаратов
Результаты
1. Рост эмбриональных фибробластов мышей в культуре
2. Количественные параметры роста и старения культур эмбриональных фибробластов мышей линий 1, 1 и СВ А
3. Пролиферативный потенциал ЭФМ линий 1, 1 и СВА
4. Время переживания клеток в неделящемся состоянии
5. Выявление активности эндогенной 3галактозидазы рН6,0
6. Пролиферативный ответ эмбриональных фибробластов мышей на стимуляцию
факторами роста
7. Уровень фосфорилирования белков но тирозиновым остаткам
8. Спонтанная трансформация
9. Теломеразная активность ТАК
. Подавление функции теломеразы с помощью ингибиторов обратных транскриптаз
. Изучение теломер и кариотила эмбриональных фибробластов мышей линий АМР1 и
Обсуждение
1. Морфологически старение клеток неотличимо от старения нормальных
мышиных фибробластов
2. Повышенная активность эндогенной ргалактозидазы рН6,0 отражает ускоренное старение эмбриональных фибробластов мышей
3. Снижение пролиферативного ответа на стимуляцию факторами роста в процессе старения эмбриональных фибробластов мышей в культуре
4. Вызывается ли спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов
мышей в культуре повышением появлением ТАК
5. Существует два пути спонтанной трансформации
6. Связь длины теломер у мышей и пролиферативного потенциала их клеток в
культуре
7. Объяснение того, как относительно длинные теломеры мыши могут индуцировать пролиферативное старение
8. Тройственная корреляция между продолжительностью жизни мышей, пролиферативным потенциалом их эмбриональных фибробластов и временем переживания состарившихся фибробластов в неделящемся состоянии
9. Повышенная нестабильность ДНК в клетках может объяснить все наблюдаемые в наших экспериментах явления
Выводы
Список литературы


Вторая группа i i мыши, резистентные к ускоренному старению и имеющие практически нормальную около полутора лет среднюю продолжительность жизни включает 3 линии. Мышей удобно использовать в экспериментах в парах опыт, контроль. В качестве объектов изучения нами были выбраны культуры эмбриональных фибробластов трех линий мышей 1, 1 и СВА СВА это линия мышей, имеющая нормальную среднюю продолжительность жизни 2,5 3 года. В нашей работе мы постарались наиболее полно охарактеризовать поведение в культуре эмбриональных клеток мышей указанных линий. Наиболее часто в литературе в качестве главной характеристики старения клеток в культуре приводится максимальное число удвоений популяции, которое могут проделать клетки i vi так называемый пролиферативный потенциал клеток. Поэтому одной из целей нашей работы было измерение и сравнение пролиферативных потенциалов эмбриональных фибробластов мышей всех трех линий. Поскольку любой многоклеточный организм состоит из делящихся и неделящихся клеток, то, теоретически, на продолжительность жизни организма должны влиять, по меньшей мере, два фактора пролиферативный потенциал делящихся и время переживания неделящихся клеток. Исходя из этого, представлялось целесообразным изучить на одних и тех же культурах не только пролиферативные потенциалы эмбриональных фибробластов мышей указанных линий, но и время их переживания в неделящемся состоянии после прекращения делений. Из литературы известно, что пролиферативный ответ клеток на стимуляцию различными факторами роста снижен у старых клеток по сравнению с молодыми. В связи с этим мы решили исследовать пролиферативный ответ эмбриональных фибробластов мышей линий 1, 1 и СВА, находящихся на различных стадиях пролиферации в культуре, на стимуляцию несколькими факторами роста и сывороткой. Показано, что эмбриональные фибробласты мыши обладают выраженной способностью к спонтанной трансформации, поэтому мы посчитали необходимым исследовать этот процесс на наших объектах. Поскольку большинство полученных нами клонов спонтанных трансформантов обладало теломеразной активностью, нами были проведены эксперименты по блокированию функции теломеразы с помощью ингибиторов обратных транскриптаз с целью выяснения роли активации теломеразы при спонтанной трансформации. В соответствии с теломерной теорией А. М. Оловникова клетка стареет из за потери последовательностей ДНК на концах хромосом вследствие их неполной репликации. Следовательно, теломеры могут играть ключевую роль в преждевременном старении мышей . Для проверки этого предположения нам было необходимо измерить и сравнить между собой теломеры мышей линий 1, 1 и СВ А. Принимая во внимание все вышесказанное, мы посчитали, что мыши и культуры их эмбриональных фибробластов представляются удобной моделью для изучения взаимосвязи старения на организмениом и клеточном уровнях. Клеточный цикл. Совокупность последовательных событий, происходящих от момента образования клетки в результате митотического деления до окончания се деления на две дочерние клетки, называют клеточным митотическим циклом. Обычно клеточный цикл у эукариот разделяют на четыре временных отрезка митоз М, нресингетичсская , синтетическая 8 и постсинтетическая фаза рис. Рис. А Клеточный цикл. Точки контроля. Состояния покоя. Б Остановка клеточного цикла в Точках контроля в ответ на стрессы согласно Копнин, . Повреждения ДНК, дефицит нуклеотидов, разрушение микротрубочек. Известно, что общая продолжительность, как всего клеточного цикла, так и отдельных его фаз значительно варьируют не только у разных организмов, но и у клеток разных органов и тканей, а также в клеточных популяциях идентичных клеток. Наиболее подвержена изменениям фаза. Предполагается, что простейший клеточный цикл может состоять только из двух фаз и М , i, . Такой гипотетический клеточный цикл имеет место во время раннего эмбриогенеза у организмов с большими яйцеклетками, например, у X и i. В этих яйцеклетках все компоненты, необходимые для многочисленных делений, пресинтезированы во время оогенеза и сохраняются в цитоплазме.