Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe

• Автор: Федянина, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 i как модельный объект исследований.

1.2 Клеточный цикл делящихся дрожжей .

1.3 Регуляция клеточного цикла у .

1.4 Митотическое деление клетки

1.4.1 Особенности митотического деления . .

1.4.2 Инициация митоза у .

1.4.3 Система клеточного контроля i и инициация анафазы

1.5 Строение микротрубочек.

1.5.1 Формирование тубулшювых димеров. Роль тубулинсвсртывающих кофакторов

1.5.2 Кофактор высших эукариот.
1.5.3 Мутации и
1.6 Центромсрасвязывающне белки .
1.6.1 и подобные белки.
1.6.2 подобный белок
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Среды и условия роста . .
Генетические методы
Метод случайных спор.
Метод тетрадного анализа.
Тест на определение температурной чувствительности.
Тест на определение типа спаривания
Методы клеточной биологии
Трансформация клеток .
Измерение частоты потери минихромосомы.
Обработка результатов теста по определению частоты потери минихромосомы.
Синхронизация клеток . в iфазс методом азотного голодания
Иммунофлуоресценция.
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ.
Часть I Сегрегация хромосом у делящихся дрожжей с мутациями кофактора
Сравнение температурочувствительности ар 1 и ар, мутантных
аллелей кофактора О.
Стабильность минихромосомы в мутантах кофактора О зависит от условий
роста клеток
Рост клеток арИ на богатой среде контролируется белками митотического
контроля чекпойнта
Неравная сегрегация хромосом в клетках с мутациями в гене, кодирующем
кофактор Б. сопровождается отсутствием метафазы в митозе
Мутации в гене, кодирующем кофактор О, чувствительны к повышению уровня
экспрессии СЕЫРВподобиого белка АЬрр.
Генетические взаимодействия между компонентами кинетохорл и веретена деления предполагают их существенную роль в установлении оптимального соединения клнетохора с микротрубочкой
Часть II Тубулпноныс димеры при нарушении функции кофактора I остаются функциональными в течение одного клеточного цикла
Клетки с мутациями сссО и клетки а1р1 имеют похожую кинетику
Клетки с мутацией а1р1 гибнут в нервом митозе при СС после
синхронизации в Орфазе
Выживаемость клеток с мутацией ар остается высокой на протяжении
сссзависимой блокировки митотического деления
Микротрубочки в клетках с мутацией ар 1 становятся сильно поврежденными через 3 часа инкубации при С пезависимо от прохождения в фазы.
Часть III Клетки ас ар, освобожденные после с1сзавиепмой блокировки митотического деления, имеют примерно часовую задержку в инициации митоза.
Появление на полюсе РЫвГР задерживается и имеет медленную кинетику в клетках с1с ар, освобожденных после сссзависимой
блокировки митотического деления
В клетках ссс ар, освобожденных после сс зависимой блокировки митотического деления, не наблюдается изменений ни в количестве, ни в длине микротрубочек, но есть изменения в их яркости
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
Генетический анализ функции кофактора О 5. ротЬе
Анализ сегрегации хромосом в клетках с мутациями кофактора Л
Продолжительность функциональности губулиновых димеров при нарушении функции кофактора 0.
Инициация митоза после сйс зависимой блокировки митотического деления.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Было показано, что мутации в гене, кодирующем кофактор Е, который является партнером кофактора в пути сборки тубулиновых димеров, приводит к возникновению у человека тяжелых синдромов, приводящих к пшопаротироидизму, задержке умственного развития и лицевому дисморфизму vi . Эти заболевания вызваны нарушениями димеризации тубулина и недостатком микро трубочек. Лучше всего биохимический путь формирования димеров изучен i vi на выделенных белках быка i . Кофакторы действуют на финальном этапе образования третичной структуры а и губулинов, способствуя формированию собственно гетсродимера. Кофакторы В и А связываются с а и тубулином соответственно i . Е и i . Присоединение кофакгора С и последующий гидролиз ГТФ завершают сборку димера i . Изучение пути свертывания тубулиновых димеров у различных организмов показало, что есть вариации в его работе. Например, у делящихся дрожжей i . А у почкующихся дрожжей vii . Основным отличием пути формирования у . Достоинством делящихся дрожжей, как объекта исследования, является простота различных генетических манипуляций, в отличие от клеток высших эукариот. Хотя у . Подобные мутации в генах, кодирующих кофакторы, приводят к исчезновению микротрубочек в клетках при роете на запрещающей температуре i I i i . Есть основания думать, что тубулиисвертываювдне кофакторы помимо сворачивапия димеров, обладают и рядом других функций в клетке. Так было показано, что кофакторы , Е и В в клетках животных при переизбытке обладают способностью разрушать димеры тубулина . Также, температурочувствитсльная мутация 2 в гене, кодирующем кофактор у . Комплекса Инициирующего Анафазу и протеасомы i . Мутации в генах, кодирующих кофакторы, приводят к разрушениям структур микротрубочек, что впоследствии приводит к неправильному делению клетки. Этот вопрос являлся целью данной работы. Цель н задачи исследования. Настоящая работа выполнялась с иелыо выявить роль кофактора , участвующего в формировании нативной конформации тубулинового димера, в митозе. Определить частоту возникновения дефектов сегрегации хромосом в клетках . С помощью генетических методов определить возможных партнеров кофактора в клетке среди белков кинетохорного комплекса. С помощью методов флуоресцентной микроскопии определить какие митотические процессы нарушены в клетках с мутациями кофактора . Исследовать причины, приводящие к медленному развитию митотических нарушений в клетках с мутациями кофактора , используя различные методы синхронизации клеточного цикла. Научная новизна. В работе показано, что клетки с мутациями кофактора имеют повышенную частоту потери минихромосомы. Мутанты кофактора генетически взаимодействует с компонентами кинетохора i 1, 2, , , что предполагает существенную роль кофактора в установлении оптимального соединения кинетохора с микротрубочкой. Оба мутанта кофактора имеют дефекгы в прохождении мегафазы. Также показано, что тсмпсрагурочувсгвителыгый фенотип не связан с прохождением
определенной фазы клеточного цикла при запрещенной температуре, белок Л1р1 перестает выполнять свою функцию уже после 2 часов пребывания при С независимо от стадии клеточного цикла. Это означает, что в клетках с мутацией в гене, кодирующем кофактор Э аргубулшювыс гетеродимеры способны функционировать на протяжении одного клеточного цикла при С. Практическая значимость. Сбой в контроле клеточного деления приводит к таким событиям для клетки, как гибель или неконтролируемый рост. Исследование различных аспектов клеточного деления позволяет продвинуться в понимании фундаментальных механизмов, обеспечивающих правильность клеточного делениям. Кроме этого, было показано, что нарушение димеризацин тубулина и недостаток микротрубочек приводит к возникновению у человека тяжелых заболеваний, таких как синдромы БащаЗакай и КеппуСаАГеу Рагуап а1. Поэтому исследование функции шаперонов тубулина является важной задачей, которая может иметь практическое значение для лечения подобных заболеваний. Мутации в кофакторе Э приводят к повышению частоты потерн минихромосомы. Степень этого эффекта зависит от условий роста клеток, от нарушений функционирования кинетохора, вызванного изменением уровня СЕЫРВподобного белка АЬр1р, а также от нормального функционирования митотического чекпойнта. АЬр1 и 1Э1з1.