Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа

• Автор: Штыря, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

Содержание

Список использованных сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Вирус гриппа

2.2.Классификация нейраминидаз

2.3.Структура нсйраминидаз

2.3.1. Цитоплазматический участок

2.3.2. Трансмембранный домен

2.3.3. Стебель

2.3.4. Голова

2.3.5. Гликозилирование
2.4.Строение каталитического центра
2.5.Механизм реакции
2.6.Ингибиторы нейраминидаз
2.6.1. Мутации в АТА, отвечающие за устойчивость вирусов к ингибиторам ИЛ
2.6.2. Мутации в НА, возникающие под действием ингибиторов ИЛ
2.6.3. Современная ситуация с возникновением резистентных штаммов вируса гриппа
2.7.Определение активности и специфичности нейраминидазы вируса
гриппа
2.7.1. Определение активности
2.7.2. Изучение субстратной специфичности
2.7.3. Известные литературные данные об олигосахаридной специфичности ИА вирусов гриппа
2.8.Корреляция активностей гемагглютинина и нейраминидазы
2.8.1. Восстановление функционального баланса в реассортантных вариантах
2.9. Восстановление функционального баланса при дефектах
вируса гриппа
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1.Метод определения активности и специфичности нейраминидаз с
помощью ВОЕ1РУмеченых олигосахаридов
4.2.Определение активности ЫА вируса гриппа
4.3.Влияние вирусных белков на действие нейраминидазы
4.3.1. Удаление ИЛ с вирусной частицы. Сравнение свободной
и вируссвязанной нейраминидазы
4.3.2. Изменчив типа гемагглютинина и Мбелка
4.4.Влияние хранения вакцинных штаммов вируса гриппа
на профиль специфичности ИА
4.5.Восстановление функционального баланса НАЫА
в реассортантных вирусах
4.6.Субстратная специфичность вирусных реассортантов
подтипа Н5И2
4.7.Субстратная специфичность ЫА вирусов подтипа Н9Ы2
4.8.Роль а.к. остатков 8, 5, 1, 9, 7, 0, 0 и 1 в функционировании нейраминидазы 2
4.9.Специфичность исследованных вирусов гриппа
общие закономерности
4 Вирусы, устойчивые к тамифлю
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. БЛАГОДАРНОСТИ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список использованных сокращений
А.к. аминокислота
ГАЕ гемагглютинируютцая единица
ДСН додецилсульфат натрия
дтдикий тип
М матриксный белок
II гсмагглютииин
НВсайт гемоадсорбционный сай г нейраминидазы
РГА реакция гемагглютииации
РНП рибонуклеопротеин
РРС разведенная реакционная смесь
РСЦ рецепторсвязывающий центр
Субстраты
i 1
3 5 1
6 6ii
6 6i 1

3i 1
x
метилумбеллиферил ацетилнейраминовая кислота
ТБК тиобарбитуровая кислота
I ,4дифторо5,7диметил4бораЗа,4адаизаиндацин3пропиониламиногексаноилвая кислота, сукцинимидный эфир дитиотреитол
этилендиаминтетраацегат фукоза
гемагглютининнейраминидаза
I международные единицы измерения активности фермента Км константа Михаэлиса манноза
линия клеток i i i нейраминидаза
буфер буфер определения активности и субстратной специфичности нейраминидаз флуоресцентным методом 5 ацетилнейраминовая кислота
5 Ас2еп 2деокси2,3дидегидроМацетилнейраминовая кислота нуклсопротеин неструктурный белок олигосахарид
V линия клеток почки африканской зеленой мартышки
ВВЕДЕНИЕ


Вирусы гриппа являются представителями семейства xvi, к которому относятся РНКсодержащие вирусы с сегментированным геномом. Генетический материал вируса гриппа закодирован в восьми сегментах РНК, два из которых, а именно и М, имеют по две рамки считывания и, поэтому, из них получаются по два белковых продукта 1 и 2, и М2 соответственно . РНК, входящие в состав вирусной частицы, лишены структуры кэпа. Так как они являются РНК, то синтез вирусных белков с них невозможен для его осуществления необходима копированная и полиаденилированная . За процесс синтеза мРНК ответственен комплекс полимеразных белков, который ворует кэиструктуры с несозревших клеточных мРНК, присутствующих в ядре, и обеспечивает полиаденилирование полученной РНК. Вирионы покрыты липопротсиновой оболочкой, на поверхности которой экспонированы белки геммаглютинин II, около белка поверхности, нейраминидаза , и М2 белок, образующий ионные каналы . Липопротеиновая оболочка вируса изнутри выстлана плотным слоем белка, взаимодействующего с цитоплазматическими участками НА и . Восемь генных сегментов плотно упакованы в белок, причем на каждый генный сегмент вириона приходится по одному комплексу полимеразных белков РВ1, РВ2 и РА. Неструктурные белки участвуют в репликации вируса и подавлении ответа па вирусную инфекцию с участием системы интерферонов. С. Вирус С, также, как и вирус В, заражает только человека и не имеет большого количества антигенных подтипов. А и В является то, что его рецепторсвязывающие и рецеиторразрушающие функции выполняются одним и тем же белком. Разнообразие антигенных подтипов вируса гриппа В гоже невелико. Хозяевами для вируса А являются не только люди, но и дикие и домашние птицы, а также многие виды млекопитающих, такие как лошади, свиньи, дельфины и кошки. Способность вируса гриппа А циркулировать в том или ином круге хозяев связана с набором подтипов НА и , для каждого вида хозяев характерен свой набор подтипов. Вирусы гриппа А выделяют из многих видов млекопитающих и птиц v . На рисунке 1 представлено филогенетическое дерево вирусов гриппа А. Для его построения за основу была взята последовательность белка , так как он, в отличие от поверхностных белков, менее подвержен изменениям. Филогенетические данные подтверждают экологические данные о том, что спектр вирусов 1риппа водоплавающих птиц является не только самым широким и разнообразным, но и самым константным, то есть эти вирусы находятся под наименьшим давлением отбора. X I3. Рисунок 1. Филогенетическое дерево гриппа А, построенное на основании нуклеотидной последовательности гена белка . Диагонально заштрихованные виды означают, что вирусы переданы в других хозяев то есть, не характерны для данного хозяина, например вирусы для человека. Н гемагглютинин, нейраминидаза, показан вид и год изолята. СК курица, V вирус чумы птиц, крачка, РА попугай, волнистый попугайчик. Цвет ветвей и типов Н и указаны после названия вируса показывает возможные реассортантыне вирусы в прямоугольниках чистые реассортанты , . В настоящее время известно шестнадцать подтипов II и девять подтипов , i . Все девять подтипов и практически все подтипы НА встречаются у водоплавающих птиц. Только три III, 2 и НЗ подтипа НА, и только два подтипа 1 и 2 вызывали в XX веке пандемии. С года только два подтипа вируса гриппа А совместно циркулируют среди людей II и . Однако, до настоящего времени ни одной эпидемии, вызванной их реассортантными вариантами не было зарегистрировано. Реассортанты, если и возникали, то всего на одиндва эпидемических сезона , а сочетание не было выявлено вообще v . Вирусы , типичные для птиц, в течение последних лег периодически выявляются у людей, однако лишены способности передаваться от человека к человеку . В популяции свиней подтип с недавнего времени циркулирует наравне с и вирусами гриппа i . В популяции лошадей обнаружены вирусы II и II, а вирусы подтипа Н выделены только от чаек и дельфинов. Таким образом, не все теоретически возможные сочетания НА и встречаются в природе. Механизмы, лежащие в основе ограниченной совместимости этих двух белков, только начинают изучаться.