Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование "инсуляторных телец" в ядрах клеток Drosophila melanogaster

• Автор: Волков, Илья Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ. ИНСУЛЯТОРЫ

1.1. Геном эукариот организован в домены

1.2. Молчащие домены

1.3. Активные домены

1.4. Границы доменов

1.5. Инсуляторы

1.5.1. Инсулятор

1.5.2. Эндогенные инсуляторы I I и инсуляторныс тельца

1.5.3. Нейтрализация инсуляторов

1.5.4. Модели действия инсулятора
1.5.5. Модификация белков vv инсулятора белком
2. НОВЫЙ УЧАСТНИК ПОСТТРАНСЛЯЦИОННОЙ МОДИФИКАЦИИ
2.1. Путь конъюгации белка
2.2. Строение белка и ферментовучастников пути сумолирования
2.2.1. Фермент Е
2.2.2. Фермент В
2.2.3. Фермент ЕЗ
2.3. Десомулирование
2.4. Сумолирование iуляторов транскрипции
2.5. Сумолирование белков, ассоциированных с репарацией ДНК
2.6. Инсуляторные белки сумолируются i vi и i viv
2.7. Протеолитический убиквитинзависимый контроль конъюгации
2.8. Формирование ядерных телец
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Штаммы бактерий, дрожжей и линия культуты клсгок
i
2.1.2. Среды для выращивания бактерий, дрожжей и культуры клеток i
2.1.3. Ферменты и реактивы
2.1.4. Олигонулеотидные праймеры
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Биохимические методы
2.2.1.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации
илазмидной ДНК
2.2.1.2. Трансформация компетентных клеток плазмидами
2.2.1.3. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.2.1.4. Полимеразная цепная реакция
2.2.1.5. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.1.6. Агарозный гельэлсктрофорез
2.2.1.7. Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций
2.2.1.8. Определение нуклеотидной последовательности
2.2.1.9. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.2.1 Культивирование дрожжей
2.2.1 Трансформация дрожжевых клеток
2.2.1 Анализ взаимодействий в двугибридной системе
2.2.1 Трансфекция 2 клеток
2.2.1 Получение клеточного лизат из 2 клеток
2.2.1 Получение ядерного лизата из 2 клеток
2.2.1 Иммунопреципитация
2.2.1 Иммунопреципитация хроматина
2.2.1 гибридизация
2.2.1 Окрашивание клеточных препаратов
2.2.1 РНКинтерфсреция
2.2.1 Детекция белков на политенных хромосомах дрозофилы.
2.2.1 Детекция белков в клетках имагинальных дисков дрозофилы.
2.2.1 Получение конструкций, экспрсссирющих белки СР0,
4.2 и его варианты в клетках i.
2.2.1 Получение конструкций для дрожжевой двугибридной системы.
2.2.1 Получение конструкций для трансформации в личинки мух
2.2.1. Генетичсские методы
2.2.1 Линии i , использованные в работе
2.2.2 Фенотипический анализ экспрессии генов
2.2.3 Трансформация эмбрионов i и получение траисгенных линий
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ЧАСТЬ I. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ ОБРАЗОВАНИЕМ ИНСУЛЯТОРНЫХ ТЕЛЕЦ И ИНСУЛЯЦИЕЙ
1. Мутантные варианты белка 4, используемые в работе
2. Локализация 4 производных в клстках
3. Распределение мутантных вариантов белка в цитоплазматической и ядерной белковых фракциях 2 клеток.
XI анализ
4. Тестирование мутантных форм белка i viv
5. Локализация призводных белка 4 в личинках
ЧАСТЬ И. ВЫЯВЛЕНИЕ ФАКТОРА, ОТВЕТСТВЕННОГО ЗА ОБРАЗОВАНИЕ ИНСУЛЯТОРНЫХ ТЕЛЕЦ БЕЛКА 4
1. Удаление сигналов ядерной локализации белка 4 влияет на распределение белка в клетке и не влияет на его инсуляторные свойства.
2. Процесс сумолирования играет ключевую роль в образовании спсклов белка 4
3. Уникальные Сконцевые домены белка 4 не нужны для образования инсуляторных телец
4. Нефункциональный белок способен образовывать спеклы
5. Выявление спеклообразующего компонента инсуляторных телец
Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


К трансрегул яторным факторам относятся РНКполимераза базовые транскрипционные факторы, входящие в состав РНКполимеразного комплекса ДНКсвязывающие транскрипционные факторы, специфично связывающиеся с последовательностями энхансеров, сайленссров, проксимальных промоторов АТФзависимые хроматинтрансформирующис факторы, которые модифицируют нуклсосомы транскрипционные медиаторы, обеспечивающие взаимодействие между связывающимися с энхансером факторами и базальной транскрипционной машиной и, наконец, белки, катализирующие ацетилирование, деацетилирование, фосфорилирование, убиквитииилирование и метилирование гистонов и других белков , i . Еще одним важным фактором, влияющим на экспрессию гена, является его расположение в ядре. Ядро структурно и функционально компартментализонано. Уровень экспрессии гена зависит от того, в каком компартменте ядра он находится i . ДНК эукариотических хромосом находится не в свободном состоянии, а прочно связана с группой небольших основных белков, называемых гистонами. ДНК. Этот нуклеопротсииовый материал хромосомы называется хроматином Страйср, . Названные компоненты хроматина образуют высокоупорядоченные в пространстве структуры. С функциональной точки зрения различают эухроматин и гетерохроматин. Эухроматин характеризуется меньшей по сравнению с гетерохроматином компактизацией ДНК, и в нем главным образом локализуются активно экспрессирующиеся гены. Геном эукариот имеет доменную структуру. Внутри доменов могут находиться либо индивидуальные гены, либо группы генов с отдельными паттернами экспрессии. По статусу экспрессии домены делятся на активно транскрибируемые и инактивированные молчащие. По чувствительности к обработке ДНКазой I домены делят на ДНКаза Iчувствительные и ДНКаза 1устойчивые домены. Домены также могут быть классифицированы по специфичным маркерным модификаторами гистонов, а также но негистоновым белкам Яагш е1 а1. Большая часть генов многоклеточных организмов эукариот экспрессируется только на определенных стадиях развития иили только в определенных тканях. Это означает, что клетки должны располагать эффективными средствами подавления транскрипции всех генов, кроме тех, которые функционируют в клетках данного вида. Репрессия больших групп генов в принципе может осуществляться путем ограничения доступности необходимых факторов транскрипции, но, иовидимому, такой механизм маловероятен. Об этом свидетельствует тог факт, что гены, обычно не экспрессирующиеся в клетках определенного типа, могут экспрессироваться при введении их в клетки путем трансфекции. Например, гены глобина после трансфекции в фибробласты экспрессируются в раз эффективнее, чем эндогенные глобиновые гены в составе хромосом более того, это различие сохраняется при последовательных клеточных делениях даже несмотря на то, что трансфицированные гены встраиваются в хромосомы. Как правило хотя и не всегда, активность транскрипции генов, переданных путем трансфекции, бывает на порядок выше, чем у соответствующих эндогенных генов. Этот феномен объясняют тем, что репрессия происходит в результате изоляции молчащих генов в хроматиновых структурах более высокого порядка, изза чего они становятся недоступными для комплексов транскрипции Сингер М. Берг П. ДНК в живой клетке упакована в иуклеопротеиновые комплексы, важным компонентом которых являются гистоны. Современные исследования модификаций ДИК и гистонов гипоацетилироваиие, убиквитинировапие и фосфорилирование гистонов, метилирование гистонов и ДНК и др. Модификации происходят в строго определнных местах молекул ДНК и гистонов. Схематично процесс инактивации можно описать следующим образом. Первым этапом является деацетил и ро ван не гистонов с помощью дсацетилаз ферментов, кодируемых высококонсервативными генами. Деацетилировамныс гистоны способны к взаимодействию с трансмстилазами, которые метилируют в них определенные аминокислоты например, лизин К9 или лизин К. Метилированные сайты являются маркерами, которые опознаются другими белковыми комплексами, компактизующими хроматин на уровне структуры высшего порядка, в результате чего образуются молчащие домены, не способные к транскрипции.