Создание эффективного олигонуклеотидного ингибитора TAQ ДНК-полимеразы

• Автор: Якимович, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ДЛЯ ДОСТИЖЕНИЯ ПОСТАВЛЕННОЙ В РАБОТЕ ЦЕЛИ НЕОБХОДИМО

БЫЛО РЕШИТЬ СЛЕДУЮЩИЕ ЗАДАЧИ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ДНК ПОЛИМЕРАЗЫ

1.1.БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ДНК ПОЛИМЕРАЗЫ.

1.2. СРАВНЕНИЕ СТРУКТУРЫ ДНК ПОЛИМЕРАЗЫ С ОСНОВНЫМИ СТРУКТУРАМИ ДНК3АВИСИМЫХ ДНКПОЛИМЕРАЗ

1.3.СТРОЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ.

1.4. ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТА.

1.5. СТРУКТУРЫ КАТАЛИТИЧЕСКИХ ЦЕНТРОВ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ
1.5.1.Строение полимеразного домена ДНКполимеразы.
1.5.2. Строение 3 5 экзонуклеазного домена ДНКпотшеразы.
1.5.3. Строение 5 3 экзонуклеазного домена ДНКполимеразы
1.6. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ
1.7. ПРИМЕНЕНИЕ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ В МЕТОДЕ ПЦР
. 7.1. Основные принципы метода ПЦР.
1.7.2.Применениеметода ПЦР в области молекулярной биологии.
1.7.3.Преимущества и ограничения метода ПЦР
1.7.4.Проблема неспецифической амплификации для ПЦР
1.7.5.Методы горячий старт для увеличения специфичности ПЦР
1.7.5.1. Горячий старт ПЦР при помощи физического отделения ДНКполимеразы от остальных компонентов смеси при низкой температуре
1.7.5.2. Горячий старт ПЦР при помощи химическимодифицированной.
ДНКполимеразы.
1.7.5.3. Горячий старт ПЦР при помощи антител к ДНКполимеразе.
1.7.5.4. Горячий старт ПЦР при помощи ДНКгеликаз
1.7.5.5. Горячий старт ПЦР с использованием праймеров со шпилечной структурой
1.7.5.6. Горячий старт ПЦР при помощи аптамеров к ДНК полимеразе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1.ИЗУЧЕНИЕ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ АПТАМЕРОВ ДЛЯ ДНК ПОЛИМЕРАЗЫ
3.1.1.Компьютерное моделирование вторичной структуры ДНКлигандов
3.1.2.Экспериментальное исследование вторичной структуры ДНКлиганда.
3.2.0ПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ДНК
ЛИГАНДА.
З.З.ВЫЯВЛЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ДНКЛИГАНДА, ОКАЗЫВАЮЩИХ ВЛИЯНИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ С ДНК ПОЛИМЕРАЗОЙ.
3.3.1.Модельная система
3.3.2.Изучение влияния однотяжевого 5 концевого участка олигонуклеотида на эффективность ингибирования ДНК полимеразы.
3.3.3.Изучение влияния двутяжевой части аптамера на эффективность ингибирования Тац ДНК полимеразы
3.3.3.1.Выявление функционально значимой длины двутяжевого участка аптамера. .
3.3.3.2. Изучение влияния нуклеотидного состава двутяжевого участка молекулы аптамера на эффект ингибирования.
3.3.4.Изучение влияния фрагмента ДНКаптамера петля па эффект ингибирования
Тац ДНК полимеразы
Последовательность петли.
3.4.ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ОПТИМИЗИРОВАННОГО АПТАМЕРА
3.4.1. Установление вторичной структуры
3.4.2.Изучение конформационных свойств аптамера в растворе.
3.4.3.Изучение особенностей взаимодействия аптамера с
Тац ДНК полимеразой.
3.4.3.1. Определение тиминовых остатков, потенциально вовлеченных в специфическое взаимодействие с Тац ДНК полимеразой.
3.4.3.2. Установление домена Тац ДНКполимеразы, участвующего во взаимодействии с ДНКлигандом.
3.4.4. Изучение взаимодействия ДНКлиганда с другими ДНКполимеразами
3.5. МОДЕЛЬ ДНКБЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В КОМПЛЕКСЕ ТА
ДНК ПОЛИМЕРАЗЫ С ДНКЛИГАНДОМ
3.6. ПРИМЕНЕНИЕ ДНКАПТАМЕРА ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЦР
3.6.1. Исследование оптимизированного ДНКлиганда как субстрата для
Тац ДНКполимеразы.
3.6.2. Применение ДНКаптамера для увеличения специфичности ПЦР.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Он относится к классу ДНКзависимых ДНКполимераз семейства I, участвующих в процессах репликации и репарации ДНК. Интерес исследователей к свойствам ДНКполимеразы вызван использованием данного фермента в полимеразной ценной реакции ПЦР одном из основополагающих методов современной молекулярной биологии и биотехнологии. В настоящее время ПЦР нашла широкое применение в клинической диагностике и научных исследованиях, связанных с анализом ДНК и РНК. Одна из основных проблем, возникающих при постановке ПЦР, образование неспецифических продуктов реакции. При температуре приготовления реакционной смеси, кроме специфического может происходить и неспецифический отжиг праймеров. ДНКполимераза обладает активностью в этих условиях, и, следовательно, может катализировать одновременную полимеризацию различных по длине фрагментов ДНК, что мешает правильной интерпретации результата. После начала ПЦР, температура реакционной смеси не опускается ниже температуры плавления отжига праймеров, и, следовательно, неспецифическое удлинение праймеров ДНКполимеразой уже невозможно. Таким образом, для решения этой проблемы необходимо создать такие условия, при которых ДНКполимераза была бы неактивна при комнатной температуре, но активировалась бы при температуре отжига праймеров. ДНКполимсразы от остальных компонентов смеси при низкой температуре. Аптамеры ДЫКлиганды, разработанные Дангом и Джайасена , связывают ДНКполимеразу при температуре С и не взаимодействуют с ферментом при температурах выше С, поэтому их так же можно использовать для увеличения специфичности ПЦР. Применение любой из перечисленных методик горячего старта приводит к увеличению специфичности ПЦР. Однако методика с использованием ДНКлигандов к ДНКполимеразе является одной из наиболее перспективных как для исследовательских работ, так и для применения в технологичеких разработках. Однако аптамеры, разработанные Дангом и Джайасена , , не позволяют решить ряд задач, поскольку ингибируют ДНКполимеразу лишь в узком диапазоне температур С. Кроме того, аптамеры инактивируют обратную транскриптазу ОТ V, необходимую для осуществления ОТПЦР в одной пробирке. Поэтому для увслечения области использования аптамеров в ПЦР и ОТПЦР, необходимо было оптимизировать их структуру. ПЦР при помощи ДНКлиганда, приводящую к увеличению специфичности и чувствительности ПЦР и ОТПЦР в одной пробирке. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Ы.Биологические функции ДНК полимеразы. ДНК полимераза термостабильный и термоактивный оптимум активности С фермент бактерии i. В г. Брок и его студент выделили из горячего источника Йеллоустоунского национального парка новый вид термофильной бактерии ему было присвоено название i. После изучения отличительных свойств этой бактерии в г. Т. Н, , а типовой штамм вида в соответствии с принятыми международными правилами помещен в Американскую коллекцию типовых культур. ДНК полимераза относится к классу ДНКзависимых ДНК полимераз I семейства. Представители семейства ДНКнолимеразы I участвуют в процессах репликации и репарации ДНК прокариотических организмов , . ДНКиолимераза I осуществляет синтез ДНК в эксцизионной репарации ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований Патрушев, , и участвует в нескольких стадиях репликации ДНК. ДНК репликация включает в себя 1 разьединение тяжей ДНК дуплекса в области инициации репликации, 2 синтез праймера и фрагмента Оказаки, 3 формирование репликационной вилки, 4 удлинение праймера на растущей цепи и синтез последовательных праймеров для удлинения отстающей цепи, 5 удаление РНК праймеров и 6 скрепление разрывов. В этот процесс вовлечено большое количество ферментов и вспомогательных белков, включая праймазу, экзоиуклеазы, геликазы, гиразы, топоизомеразы и белки, связывающиеся с однотяжевыми фрагментами ДНК, которые стимулируют активность ДНКнолимеразы и увеличивают точность и ироцессинность. Поэтому для понимания этих сложных молекулярнобиологических процессов необходимо изучить структуру и механизм действия как отдельных белков, так и межмолекулярных комплексов.