Сворачивание тРНК

• Автор: Серебров, Виктор Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Роль и других катионов в формировании нативной структуры тРНК

1.1. Связывание катионов стРИК

1.2. Координация 2 в трехмерной структуре тРНК.1о

1.3. Структурные эффекты при связывании 2 с тРНК.

Глава 2. Влияние минорных нуклеотидов на конформацию и функции гРНК.

2.1. Акцепторная функция тРНК.

2.2. Адапторная функция тРНК

2.3. Конформация тРНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы.
3.1. Материалы и методы, использованные для получения препаратов тРНК.
3.1.1. Выделение и очистка тРНК.
3.1.2. Получение тРНК транскрипцией i vi.
3.1.3. Введение флуоресцентных меток в тРНК.
3.2. Методы исследований
3.2.1. Метод остановленного потока
3.2.2. Измерение радиусов Стокса тРНК методом гельфильтрации.
3.2.3. Спектроскопия УФ и КД.
3.2.4. Температурное плавление тРНК.
3.2.5. Флуоресцентная спектроскопияг
3.2.6. Измерения связывания 2 с тРНК.
3.2.7. Ограниченный РНКазный гидролиз и метод химических модификаций.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 4. Исследование индуцированного сворачивания дрожжевой тРНКРЬс
4.1. Равновесные конформациониые переходы дрожжевой тРНКРНс при повышении концентрации 2
4.2. Кинетика Мдиндуцированного сворачивания дрожжевой тРПКРЬе.
Глава 5. Исследование влияния минорных нуклеотидов тРНКге . i на
ее структуру и связывание 2 в растворе
5.1. Влиянде миноров на температурную стабильность тРИК
5.2. Влияние миноров на конформацию тРНК и связывание 2.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В последние годы, с увеличением числа расшифрованных структур РНК и в результате исследования механизма функционирования рибозимов достигнут большой прогресс в понимании вклада ионов металлов в формирование активной конформации РНК. Все же, несмотря на все увеличивающийся обьем данных о структуре разнообразных РНК и их фрагментов, на сегодняшний день тРНК остаются наиболее изученным семейством РНК, для которых доступны как рентгеновские структуры в кристаллах, так и данные о структуре и конформации в растворе. Поэтому использование тРНК для изучения сворачивания РНК позволяет сочетать результаты более ранних работ с новыми данными. Несмотря на свой малый размер, молекулы тРНК содержат все известные сегодня типы третичных взаимодействий РНК, за исключением псевдоузла. Дополнительный интерес представляет то обстоятельство, что тРНК, в отличие от всех других известных тРНК, содержат множество разных минорных оснований, составляющих в некоторых тРНК до 1Л от всех нуклеотидов, что вносит новые элементы в их трехмерную структуру и стабильность. Пели работы. Сравнительное изучение структуры и стабильности зрелой тРНК и транскрипта ее гена, не содержащего минорных оснований, с целью выявления роли минорных оснований в формировании структу ры. Исследование сворачивания тРНК, индуцированного ионами . Установление механизма сворачивания в терминах элементарных кинетических этапов и поиск интермедиатов сворачивания. Научная новизна и практическая значимость. Используя ковалентно присоединенные флуоресцентные метки было впервые продемонстрировано, что при связывании 2 тРНК последовательно претерпевает А конформационных перехода. Похазгно, что два из них не сопровождаются изменением числа пар оснований и относятся к чисто конформациониым. На основе кинетических экспериментов определены временные параметры для отдельных этапов формирования нативной структуры. Выявлено присутствие альтернативной конформации тРНК, которая повидимому имеет вторичную структуру, отличную от клеверного листа. Эта конформация обуславливает существование параллельного пути сворачивания в нативную конформацию при добавлении . Показана значительная стабилизация альтернативной конформация при связывании ионов 2 что приводит к повышению энергии активации ее перехода в нативную форму и кинетическому затормаживанию этого процесса. Для тРНКр1к из . 2. Продемонстрировано, что присутствие миноров значительно повышает стабильность третичной структуры тРНК и сродство 2связывающнх центров. На основе ряда подходов были сделаны выводы о степени влияния минорных нуклеотидов на компактность и конформацию тРНК, а также на механизм индуцированного сворачивания. Мд2 способна компенсировать отсутствие минорных нуклеотидов в молекуле транскрипта. Изучение пространственной структуры молекул тРНК в растворе начапюсь задолго до того, как в г. РНК , . Наряду с чисто физическими подходами спектроскопия УФ, КД и ЯМР, калориметрия, флуоресценция минорных оснований тРНК и искуственно введенных меток гидродинамические методы и т. РНК к гидролизу различными нуклеазами, фото и химические сшивки Киселев и др. Позднее к этим методам дебяачли эффективные средства генной инженерии, позволяющей осуществлять сайгнаправленный мутагенез молекулы тРНК, что сделало возможным проводить систематические исследования связи первичной структуры макромолекулы с ее функцией и трехмерной структурой. Однако, достаточно полные данные по структуре тРНК были получены только в середине х годов после расшифровки рентгенограмм кристаллов дрожжевой тРНКРЬс i . . Кроме последней, с достаточно высоким разрешением 3 РНКАф . РНК0 v i, . Были получены кристаллы и других индивидуальных тРНК тРНК1Лкс из . . РНКу из дрожжей i . А, что недостаточно для анализа особенностей пространственной структуры этих тРНК. Рентгеноструктурные модели в целом подтвердили правильность представлений о вторичной и третичной структурах тРНК, вынесенных из результа тов работ по исследованию тРНК в растворе.