Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры

• Автор: Степаненко, Ольга Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Цель и задачи исследования.

Ос ювные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна исследований.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о фолдинге белков.

1.1.1. Сворачивание белков в клетке.

1.1.2. Модель энергетической воронки. Роль внутри и межмояекупярных взаимодействий в фолдинге и нарушении фолдинга белков

1.2. Периплазматические ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ

1.2.1. ОгилактозаОглюкозасвязывающий белок из ii со .
1.2.1.1. Структура и его комплекса с ОглюкозойЭгалактозой
1.2.1.2. Спектральные свойства и .
1.2.1.3. Тепловая денатурация . Роль лигандов глюкозы и иона кальция в стабилизации структу ры белка
1.2.2. Глутамин связывающий белок из ii со .
1.2.2.1. Структура в свободном состоянии и в комплексе с i.
1.2.2.2. Спектральные свойства и I.
1.2.2.3. Изучение структуры и стабильности и комплекса при тепловой денатурации
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы
2.2. Методы.
2.2.1. Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых и тирозииовых остатков.
2.2.2. 1луоресцентные измерения.
2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции
2.2.4. Круговой дихроизм
2.2.5. Измерение равновесных кривых денатурации.
2.2.6. Измерение кинетических кривых разворачиваниясворачивания белков.
2.2.7. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачиванияразворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы.
2.2.8. Расчет констант скоростей процессов сворачиванияразворачивания
2.2.9. Расчет термодинамических параметров
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Процессы сворачиванияразворачивания и его комплекса
3.1.1. Анализ микроокружения триптофановых и тирозиновых остатков в отсутствие и в присутствии лиганда.
3.1.2. Триптофановая флуоресценция и его комплекса с глюкозой в нативном и полностью развернутом состоянии
3.1.3. Разворачивание и под действием
3.1.4. Ренатурация .
3.1.5. Тепловая денатурация и .
3.1.6. Отщепление иона кальция
3.2. Процессы сворачиванияразворачивания и его комплекса .
3.2.1. Триптофановая флуоресценция и его комплекса с i в нативном и полностью развернутом состояниях.
3.2.2. Характеристика микроокружения триптофановых остатков .
3.2.3. Флуоресцентные свойства и характеристика микроокружения триптофановых остатков комплекса i.
3.2.4. Тирозиновая флуоресценция
3.2.5. Зависимость триптофановой флуоресценции от длины волны возбуждения
3.2.5. Разворачивание и САп под действием . Равновесные зависимости.
3.2.6. Кинетика разворачивания под действием .
3.2.7. Параметрическое представление процессов разворачивания
3.2.8. Ренатурация .
3.2.9. Тепловая денатурация и комплекса i. Стабилизация структуры при взаимодействии с лигандом.
3.3. Сравнение характера процессов разворачиваниясворачивания с
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Исследования структуры и путей образования денатурированных частичпосвернутых агрегированных ассоциированных форм белков важны не только для решения фундаментальной проблемы фолдинга белка, но также имеют существенное практическое значение для медицины в связи с заболеваниями, связанными с нарушением фолдинга белков , , , , i, v . Гусев, , i . Белки являются одним из основных компонентов всех живых организмов и выполняют в клетке и в живом организме в целом самые разнообразные функции строительные, транспортные, каталитические, регуляторные, они обеспечивают движение, передачу сигналов, запасание энерг ии и т. Процесс образования белков в клетке состоит из двух этапов биосинтеза полипептидной цепи и ее сворачивания в нативную трехмерную структуру. Первый процесс, состоящий в считывании информации о последовательности и числе аминокислот, хранящейся в ДНК, и сборке аминокислот в пол и пептидную цепь, с образованием первичной езруктуры белка, хотя и является очень сложным, к настоящему времени хорошо изучен. На втором этапе происходит фолдинг сворачивание, складывание цепочки аминокислот, из которых образован данный белок и которые определяют его первичную структуру, в уникальную трехмерную структуру. Только после сворачивания в уникальное, компактное, высокоорганизованное нативное состояние белок становится функциональноактивным. Фолдинг белка в клетке всегда сопряжен с его синтезом. Сходя с рибосомы вновь синтезированная полипептидная цепь сразу попадает в густонаселенную среду клетки. В связи с этим фолдинг белка в клетке осложнен, вопервых, высокой вероятностью возникновения нежелательных контактов с соседними молекулами i, , , , и, вовторых, возникновением неправильных контактов внутри полипептидиой цепи. Для правильного сворачивания белков в клетке существует целый набор специализированных помощников. К ним относятся шапероны i, . Кузнецова и др. Шапероны или белки теплового шока представляют обширный класс белков, различающихся по молекулярной массе, структуре и функции. Они способствуют котрансляционному сворачиванию полипептидных цепей, что особенно важно при синтезе больших мультидоменных белков, препятствуют агрегации денатурированных белков, ускоряют процесс перехода белка из промежуточного в нативное состояние, участвуют в транспорте белков к местам их назначения, в частности, обеспечивают перенос белков через мембраны , . Несмотря на существенную роль помощников при фолдинге белка в клетке, они лишь способствуют фолдингу белков, но нс несут той информации о структуре, которая необходима полипептидиой цепи для приобретения ею уникальной нативной структуры. Модель энергетической воронки. Основным подходом для решения проблемы фолдинга белка является изучение процессов сворачиванияразворачивания белков i vi с использованием различных физических методов, дающих информацию о структуре белка. Методы малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, седиментации, вискозиметрии и проникающей гель хроматографии дают информацию о размерах и форме макромолекул ы, методы кругового дихроизма в дальней УФобласти и инфракрасной спектроскопии о вторичной структуре белка, круговой дихроизм в ближней УФобласти спектра и собственная флуоресценция о третичной струкгурс белка . Метод сканирующей адиабатной микрокалориметрии даст информацию о термодинамических характеристиках процесса денатурации ivv, i, . Флуоресценция гидрофобного красителя АНС 1анилинонафталин8сульфонат используется для тестирования гидрофобных кластеров на поверхности белка и возникновения аморфных щрегатов v . Другой флуоресцентный краситель тиофлавин Г используется для тестирования амилоидных фибрилл, богатых рскладчатыми структурами. Свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход флуоресценции. При встраивании в амилоидные фибриллы квантовый выход флуоресценции тиофлавина Т возрастает на три порядка Vi, Воропай и др. Как впервые было продемонстрировано Анфимсеном, аминокислотная последовательность полипептидной цепи содержит всю информацию, необходимую для его фолдинга в нативную структуру явление спонтанной самоорганизации белков было продемонстрировано группой Анфинсена на примере бычьей рибонуклеазы i, . В последующем способность к ренатурацин была показана для ряда других однодоменных белков относительно небольшого размера i, , а i, , .