Сигнальные белки нервных окончаний GAP-43 и BASP1 : Структурные и функциональные аспекты

• Автор: Захаров, Владислав Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 157 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Сфуктурные и биохимические свойства белков ОАР и ВА8Р1 .

1.1.1 Физикохимические свойства.

1.1.2 Первичная структура белков ОАР и ВАБР

1.1.3 Взаимодействие с мембраной.

1.1.4 Фосфорилирование и дефосфор и л ирование.

1.1.5 Взаимодействие с кальмодулипом.

1.1.6 Протеолиз белка ОАР.

1.1.7 Взаимодействие белка ОАР с Рактином
1.1.8 Активация белка Оо белком ОАР.
1.1.9 Гидродинамические свойства белка ОАР
1.2 Функциональная роль белков ОАР и ВАБР
1.2.1 Участие белков ОАР и ВА8Р1 в нейритогенезе и нейрорегенерации.
1.2.1.1 Экспрессия ОАР иВАБР в онтогенезе. ОАРгипотсза.
1.2.1.2 Влияние экспрессии ОАР и ВА5Р1 на морфологию
клеток и конусов роста
1.2.1.3 Роль белков вАР и ВА5Р1 в нейрорегенерации.
1.2.1.4 Сверхэкспрессия ОАР и ВА8Р1 в трансгенных мышах
1.2.1.5 Нокаут генов ОАР и ВА5Р1 у мышей
1.2.1.6 Молекулярные механизмы функционирования белков
ОАР и ВАБР
1.2.2 Роль белка ОАР в пластичности нервной системы.
1.2.3 Роль белка ОАР в секреции нейромедиатора
1.2.4 Роль белка ОАР в регуляции нейронного апоитоза
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1 Материалы исследования.
2.2 Субклеточное фракционирование нервной ткани
2.3 Выделение белков ОАР и А8Р1.
2.3.1 Экстракция белков ОАР и ВАБР тритоном X0хлорной
кислотой .
2.3.2 Экстракция белков ОАР и ВАбР хлороформом
фихлоруксусной кислотой
2.4 Эндогенный протеолиз белка ОАР в синапгосомах и цитозоле
2.5 Одномерный электрофорез белков в полиакриламидном геле.
2.5.1 Электрофорез в системе уксусная кислотмочевина
2.5.2 Электрофорез в системе уксусная кислотамочевинатритон Х
Содержание
2.5.3 Электрофорез с додецилсульфатом натрия
2.5.4 Электрофорез в неденатурирующих условиях
2.5.5 Окраска белков в полиакриламидном геле.
2.6 Двумерный элекфофорез белков в полиакриламидном геле.
2.7 Препаративный электрофорез белков.
2.8 Иммуноблотгинг белков
2.9 Пептидное картирование.
2. Гельфильтрация.
2. Другие методы.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Обнаружение белков, иммунохимически родственных белкам
АР и
3.2 Специфический кальцийзависимый протеолиз белка .
3.2.1 Содержание фрагментов белка 2 и
в мозге крысы.
3.2.2 Распределение фрагментов АР2 и 3 в клетке
3.2.3 Протеолиз белка в синаптосомах и цитозоле.
3.2.4 Молекулярноструктурные особенности белка как
су бстразд калы шина
3.2.5 Кальциевая зависимость протеолиза белка в синаптосомах
3.2.6 Протеолиз белка под действием очищенного кальпаина4.
3.2.7 Физиологическая значимость специфического протеолиза белка
3.3 Минорные изоформы белка 1.
3.3.1 Содержание минорных изоформ белка 1 в мозге крысы.
3.3.2 Оценка молекулярной массы минорных изоформ белка I
3.3.3 Миристилирование минорных изоформ белка 1.
3.3.4 Минорные изоформы белка 1 в различных тканях .
3.3.5 Минорные изоформы белка 1 у различных млекопитающих1.
3.3.6 Пептидное картирование минорных изоформ белка 1 коровы.1.
3.3.7 Механизм образования минорных изоформ белка 1.Д
3.4 Гидродинамические свойства белков и 1 .
3.4.1 Образование мультимерных комплексов белками и
3.4.2 Влияние различных факторов на агрегацию белков и 1.
3.4.3 Оценка гидродинамических характеристик мономеров
и 1.
3.4.4 Оценка размеров гомомультимерных комплексов белков
и 1.
4. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИ ТЕРАТУРЫ
Список сокращений
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ГДФ гуанозин5дифосфат
ГКС ганглиозные клетки сетчатки
ГТФ гуанозин5трифосфат
дбцАМФ дибутирилцАМФ
ДАТД диаллилтартардиамид
ДМСО диметилсульфоксид
ДСН додецилсульфат натрия
ДТТ дитнотрейтол
ЗХ зрительная хиазма
ИФР1 инсулинподобный фактор роста
ККИ казеиновая киназа II
НСГ нейроны спинальных ганглиев
ПЛАГ полиакриламидный гель
ПКС протеинкиназа С
ГШС периферическая нервная система
с.к.о. среднеквадратичное отклонение
ТЕМЕД тетраметилэтилендиамин
ТФУ трифторуксусная кислота
ТХУ зрихлоруксусная кислота
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
ФРН фактор роста нервов
ФРФ фактор роста фибробластое
цАМФ аденозин3.5циклофоефат
Щ1С центральная нервная система
ЭДТА зтилендиаминтетрауксусная кислота
1 i i i1 СаМ кальмодулин
iiv , калы тин кальцинейрин
ГА этилендиоксидиэтилендинитрилотетрауксусная кислота i i 2 фрагмент белка 3 фрагмент 6 белка
V vi, большие плотные синаптические пузырьки ii, долговременная потенциация метилОаспартат
V vi, маленькие синаптические пузырьки
Введение
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


При этом с увеличением концентрации ПААГ значение кажущейся молекулярной массы белков и 1 понижается, приближаясь к истинному значению молекулярной массы этих белков. Возможной причиной такого поведения является слабое связывание их молекул с ДСН вследствие крайне высокой гидрофильности , . Белки и 1 устойчивы к тепловому воздействию. Несмотря на то, что изоэлектрические точки белков и 1 лежат в кислой области, эти белки имеют высокую подвижность при электрофорезе в ПААГ в системе уксусная кислотамочевина при 3. Это можно объяснить наличием в составе их молекул значительного числа положительно заряженных аминокислотных остатков лизина. Высокая гидрофильность белков и 1 объясняется их очень необычным аминокислотным составом, являющимся среди белков практически уникальным. Для аминокислотного состава этих белков характерны следующие особенности табл. Высокое содержание как положительно, так и отрицательно заряженных аминокислотных остатков, главным образом, лизина и глутаминовой кислоты. Суммарное содержание заряженных аминокислот составляет около всех остатков. Табл. I 3 1. V V 7 3. Общ. Так, например, белок ВАБР содержит по одному остатку лейцина Ьеи4 и тирозина Туг, и несколько остатков валина. Исключением является очень большое содержание в белках САР и ВА8Р1 аланина аминокислоты с довольно низкой гидрофобностью. Высокое содержание пролина. Вследствие его неравномерного распределения по молекуле, в некоторых областях его содержание особенно велико. Например, в белке ВАБР крысы содержание пролина на участке 7 достигает . Высокое содержание серина и треонина суммарно около . Хотя физикохимические свойства белков и 1 очень сходны, между ними существует одно важное отличие. Оно заключается в том, что наряду с высокой гидрофильностью, белок 1 обладает свойствами, характерными для гидрофобных белков vi . Гидрофобные свойства белка 1 связаны с тем, что его конец ацилирован остатком миристиновой кислоты С 0. Это имеет несколько последствий. Вопервых, полная экстракция белка 1 из гомогената 5ной хлорной кислотой можег быть осуществлена лишь в присутствии сильного неионного детергента 1 Тритона Х0 или хлороформа, в то время как значительная часть белка экстрагируется 5ной хлорной кислотой. Это связано с участием остатка миристиновой кислоты в прикреплении молекулы белка 1 к мембране. Вовторых, добавление в ПААГ Тритона Х0 при проведении электрофореза в системе уксусная кислотамочевина приводит к сильному уменьшению подвижности белка 1, в то время как подвижность белка остается неизменной. Это связано с взаимодействием остатка миристиновой кислоты с присутствующими в геле мицеллами детергента. В настоящее время определены шинокислотные последовательности белков и 1 целого ряда организмов. Белок АР известен у млекопитающих, птиц, земноводных и рыб рис. У дрозофилы было найдено два белка продукты гена i, содержащие участки, похожие на кальмодулинсвязывающий домен белка с сайтом фосфорилирования протеинкиназой С так называемый Iдомен, однако сходство с белком ограничиваюсь этими участками , . Iдомсн IXXXXXX был обнаружен также у ряда белков, имеющих совершенно другие функции, но способных, также как и , связывать кальмодулин, свободный от ионов кальция i3, , и у некоторых других см. Как видно из рис. Интересно, что аминокислотная последовательность была более устойчивой к изменениям в эволюционном процессе, чем последовательность 1 табл. Наибольшую степень консервативности имеет концевая часть молекул белков АР и 1. С я . С . С . С. ига . Цр
гатЭЕЕ. I. . К i . ЩЕ I . Рис . Сравнение аминокислотных последовательностей белков ОАР рыб Сала1и аигашз и Оапю геПо, лягушки С 1ае птиц канарейки и курицы и млекопитающих крысы, мыши, коровы и человека, выровненных по совпадающим аминокислотным остаткам Аминокислотные остатки, совпадающие, по крайней мерс, у пяти последовательностей, выделены черным фоном. Рнс. Сравнение аминокислотных последовательностей белков ВАБР курицы, крысы, коровы и человека, выровненных по совпадающим аминокислотным остаткам Аминокислотные остатки, совпадающие, по крайней мере, у двух последовательностей, выделены черным фоном.