Реактивация противоопухолевого белка p53 в клетках человека, содержащих высокоонкогенный вирус папилломы

• Автор: Кочетков, Дмитрий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : ил.

Содержание

Список принятых сокращений

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

1.1 Общая характеристика фактора р

1.1.1 Молекулярная организация гена р

1.1.2 Доменная организация белка р

1.2 Стабилизация и активация р

1.2.1 Ингибирование р при помощи убиквитиновой лигазы 2

1.2.2 Посгтрансляционные модификации белка р

1.3 Латентная и активная формы р

1.4 Клеточные и тканеспецифичные эффекты белка р
1.4.1 Гены необходимые для ареста клеточного цикла
1.4.2 Гены участвующие в репарации
1.4.3 Г ены кодирующие ингибиторы ангиогенеза и другие секрстирусмые факторы
1.4.4 Тканеспецифичность клеточного супрессора р
1.4.5 риндуцирусмый апоптоз
1.4.6 Выбор между апоптозом и арестом клеточного цикла
1.5 Белок белковые взаимодействия р
1.5.1 Взаимодействие р с клеточными белками
1.5.1.1 Взаимодействие р с ТАТАсвязывающим белком ТВР и ТВРсвязаниыми факторами
1.5.1.2 Взаимодействие р с РНКполимеразой II, а также с элонгационным фактором
1.5.1.3 Комплекс р с связывающим белком СВР и рЗОО
1.5.1.4 Взаимодействие р с белком репарационной системы Ыа1
1.5.1.5 Роль транскрипционного фактора р в контроле пролиферации клеток эпителия
1.5.2 Взаимодействие фактора р с вирусными белками
1.5.2.1 Взаимодействие с аденовирусными белками
1.5.2.2 Связывание с белками вируса гепатита В
1.5.2.3 Механизм взаимодействия с ретровирусными белками
1.5.2.4 Связывание р с большим Тантигеном вируса БУ
1.5.2.5 Взаимодействие с белками папилломавируса человека ПРУ
2.1 Характеристика генома папилломавирусов
2.1.1 Геном НРУб
2.1.2 Роль белка Е7
2.1.3 Трансформирующая роль белка Е5
2.1.4 Белок Е6 и его функции
2.1.4.1 Структура белка Е6
2.1.4.2 Взаимодействие клеточных белков и вирусного онкогена Е6
2.1.4.3 Взаимодействие Е6 и р Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка
2.2 Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов
2.3 Измерение концентрации белка по методу Бредфорд
2.4 Фракционирование белков в полиакриламидном геле
2.5 Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетскция
2.6 Норзерн блот анализ
2.7 ОТПЦР анализ
2.8 Выделение геномной ДНК из клеток эукариот
2.9 Получение компетентных клеток Е.соН и трансформация
2. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК
2. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей
2. Реакция лигирования
2. Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получение клеточных линий
2. Окрашивание клеток с помощью реагента ОИРС для количественного определения эффективности работы репортерного гена ргалактозидазы.
2. Окраска клеток на ХОа1 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Разработка и оптимизация репортерной системы, позволяющей определять изменения
активности р в клетках рака шейки матки.
3.2 Испытание репортерной системы на различных клеточных линиях после обработки ДНКповреждающим агентом 5фторурацилом.
3.3 Поиск модельных условий для индукции рзависимого репортерного гена в НРУпозитивных клетках рака шейки матки.
3.4 Отбор химических соединений, способных реактивировать р в НРУпозитивной линии клеток рака шейки матки.
3.5 Функциональные свойства классов химических соединений, способных реактивировать р в линии клеток НсЬа.
3.6 Специфичность действия активных соединений в отношении НРУпозитивных клеток НеЬа.
3.7 Активация репортерного гена в клетках НсЬа коррелирует с индукции эндогенных геновмишеней р.
3.8 Реактивация р некоторыми из активных соединений связана с подавлением транскрипции вируса папилломы человека.
3.9 Соединения РЛЕ9 и РЯЕ0 снижают уровень экспрессии белка Е6.
3. РЮ соединения специфически снижают выживаемость НРУпозитивных клеток рака шейки матки НеЬа.
3. РЕ9 индуцирует апоптоз в НРУпозигивных клетках НеЬа.
3. Комплиментарное взаимодействие 5 классов химических веществ с соединением РКЕ9 в различных концентрациях, на клеточной линии НеЬа
3. Противоопухолевая активность рреактивирующего соединения РЯЕ9.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Глава 1. Комплекс р с связывающим белком СВР и рЗОО
1. Взаимодействие Е6 и р Глава 2. Выделение геномной ДНК из клеток эукариот
2. Получение компетентных клеток Е. Окрашивание клеток с помощью реагента ОИРС для количественного определения эффективности работы репортерного гена ргалактозидазы. Окраска клеток на ХОа1 Глава 3. Испытание репортерной системы на различных клеточных линиях после обработки ДНКповреждающим агентом 5фторурацилом. Поиск модельных условий для индукции рзависимого репортерного гена в НРУпозитивных клетках рака шейки матки. Отбор химических соединений, способных реактивировать р в НРУпозитивной линии клеток рака шейки матки. Функциональные свойства классов химических соединений, способных реактивировать р в линии клеток НсЬа. Специфичность действия активных соединений в отношении НРУпозитивных клеток НеЬа. Активация репортерного гена в клетках НсЬа коррелирует с индукции эндогенных геновмишеней р. Реактивация р некоторыми из активных соединений связана с подавлением транскрипции вируса папилломы человека. Соединения РЛЕ9 и РЯЕ0 снижают уровень экспрессии белка Е6. РЮ соединения специфически снижают выживаемость НРУпозитивных клеток рака шейки матки НеЬа. РЕ9 индуцирует апоптоз в НРУпозигивных клетках НеЬа. Противоопухолевая активность рреактивирующего соединения РЯЕ9. СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ. А.о. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ВВЕДЕНИЕ. Одной i важнейших проблем молекулярной биологии является регуляция клеточного цикла, которая осуществляется за счт скоординированного взаимодействия между компонентами различных сигнальных путей. Одним из основных регуляторных элементов данной цепи являются транскрипционные факторы, осуществляющие регуляцию транскрипции генов. Важную роль при этом играют, как специфическое и неспецифическое ДНКсвязывание, так и белокбелковые взаимодействия, которые могут носить как ингибиторный характер, так и активационный. Белок р известный антионкоген, является транскрипционным фактором, и выполняет негативную регуляцию клеточного деления остановка клеток в фазах клеточного цикла или апоптоз при активации в результате стрессового воздействия УФ, гаммаоблучение, химические мутагены, активация онкогенов vi, . Это осуществляется за счт изменения экспрессии геновмишеней, которые имеют рсвязывающие элементы . Наиболее важную роль в задержке клеток в фазе клеточного цикла играет белок , ингибитор циклинзависимых киназ i . Экспрессия гена 1, кодирующею этот белок, регулируется при участии р i . Остановка поврежденных клеток в фазе клеточного цикла связана, вероятно, также с активацией и другого рреспонсивного гена . Индукция зависимого апоптоза обусловлена, повидимому, активацией гена проаноитотического белка Вах ii, , , а также ряда других генов, продукты которых стимулируют апоптоз , , группа генов I и т. О ключевой роли нарушений функции р в процессах канцерогенеза свидетельствует тот факт, что примерно в половине всех опухолей человека обнаруживаются мутации гена р i, .