Стабилизация структуры λ-CRO с заменой Val55→Cys и специфичность его взаимодействия с ДНК

• Автор: Гительзон, Георгий Иосифович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 106 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Роль Сгорепрессора в жизненном цикле бактериофага X.

2.2. Организация пространственной структуры Сго.

2.3. Молекулярные основы взаимодействия Сго и ДНК.

3. Материалы и методы.

3.1. Используемые материалы и реактивы.

3.2. Выделение и очистка препаративных количеств Сго и СгоУС.

3.3. Модификация БНгрупп СгоУС.

3.4. Физические методы исследования структурной и термодинамической организации Сго и СгоУС.
3.5. Методы определения параметров связывания Сго и СгоУС с синтетическими аналогами операторных ДНК.
4. Результаты и обсуждение.
4.1. Оптимизация условий выделения Сго и СгоУС.
Сго Сгорепрессор бактериофага X дикого типа.
СгоУС мутантная форма Сгорепрессора бактериофага X с заменой Уа5Суз.
4.2. Сравнительные термодинамические и структурные
исследования Сго и СгоУС.
4.3. Изучение влияния замены Уа5СуБ на
ДНКсвязывающую активность Сго.
5. Выводы.
6. Список литературы.
Введение


Регуляция экспрессии генов в значительной мере осуществляется посредством избирательного взаимодействия специальных белков факторов транскрипции и регуляторных участков ДНК. Белковые факторы транскрипции способны формировать как неспецифические комплексы с двухцепочечными участками ДНК произвольной последовательности, так и специфические комплексы с уникальными последовательностями ДНК в составе определенных регуляторных генов, например, операторов аэЬпе, Кодбсюш е1 аЬ, . Полученные за последние годы структурные данные показали, что процесс формирования специфического ДНКбелкового комплекса предполагает значительные сопряженные конформационные изменения обоих его компонентов. Таким образом, хмоделирование и управление специфичностью ДНКбелковых взаимодействий требует понимания деталей структурной и термодинамической организации обоих их участников. А, и выяснению механизма влияния точечной аминокислотной замены Уа5Суз на стабильность и функциональную активность белка Сго. Роль Сгорепрессора в жизненном цикле бактериофага X. Проблема поиска и связывания определенных последовательностей ДНК белками факторами транскрипции относится к фундаментальным проблемам молекулярной биологии и исследуется с использованием различных теоретических и экспериментальных подходов. Система взаимодействия Сгорепрессор операторная ДНК бактериофага X относится к наиболее детально изученным примерам так называемого сайтспецифичного ДНКбелкового узнавания см. Марка Пташне , i i. Сгорепрессор один из ключевых регуляторов транскрипции, определяющих альтернативные литический и лизогенный пути жизнедеятельности бактериофага X. Классическая схема действия Сго. I или Хрепрессор и его, кодирующего функционального антагониста репрессора белок Сго. Ген, регулирующий экспрессию гена репрессора с, был обнаружен в серии экспериментов с мутантами фага X, проведенных в конце х начале х годов XX века. X бактериальной клетке содержится какойто фактор, который наряду с другими функциями может инактивировать репрессор или предотвращать экспрессию гена . Напротив, первоначально Эйзен и соавторы предположили, что неиммунная лизогенная клетка не содержит регулятора репрессора, а транскрипция гена непосредственно подавляется направленной вправо транскрипцией i . Аналогичное предположение высказал и Шибальский i, , основываясь на данных Тэйлора и соавторов . Еще в ряде работ были также получены указания на существование антирепрессора. Наконец, Харви Эйзен и соавторы прямо показали с помощью тестов на комплементацию фагов i . X, действуя как регулятор. В аналогичных условиях у лямбдоидного фага 4 также происходит экспрессия сходного гена, подавляющего иммунитет профага 4. Эйзен и соавторы выделили мутантов фага X, дефектных по регулятору репрессора, и назвали соответствующий ген его. Название гена и соответствующего белка происходит от сочетания i . В ранних работах этот же ген иногда обозначался как от сочетания i Xx i по терминологии Жани Перо Рего, . В состоянии лизогении из всех фаговых генов X экспрессируется только ген с, экспрессия других генов подавлена, а хромосома фага интегрирована в хромосому клеткихозяина и передается дочерним клеткам как ее составная часть. Литический путь развития принято связывать с началом экспрессии гена его, приводящей к резкому падению уровня экспрессии гена с, активации так называемых поздних фаговых генов, усиленному синтезу ДНК фага и белков, формирующих его частицы. Результатом литического пути является лизис бактериальной клетки и освобождение новых инфекционных фаговых частиц. С х годов прошлого века принято считать, что естественная функция Сгорепрессора в регуляции жизненного цикла фага X состоит в специфичном связывании определенных участков фаговой ДНК операторов в области промоторов от i ii, от i и от ii Прочно связываясь с этими участками, Сго конкурентно ингибирует связывание с ними репрессора I . Гены и его соседствуют в хромосоме фага X, причем транскрипция их происходит в противоположных направлениях. Промоторы обоих генов и расположены в пределах одной операторной области, 0 рис. X, происходят именно в области 0.