Разработка метода локализованного мутагенеза по местам связывания ДНК-белок

• Автор: Гусев, Виктор Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 159 c. : ил

Суть методов, использующих рестриктазы для направленного введения мутаций,заключается в следующем. Небольшие кольцевые двуспиральные молекулы ДНК, с одним сайтом рестрикции обрабатываются соответствующей рестриктазой в условиях образования однонитевого разрыва. Таким образом создаются условия модификации ДНК в строго заданном районе. В работе i, , в качестве адресующего агента, направляющего действие мутагена в определенное место ДНК,авторы использовали эндонуклеазу , для которой имеется один сайт рестрикции на ДНК вируса обезьян V. В условиях образования однонитевого разрыва . ДНК рис. I. Далее, используя экзонуклеазную активностью ДНКполимеразы I в црисутствии одного трифосфата в разорванной цепи ДНК образовывали однонитевую брешь. Модификацию оснований проводили бисульфитом. Последний реагирует с цитозином, находящимся в составе однонитевой ДНК, модифицируя его ДО урацила i, i, i . В присутствии всех трифосфатов и ДНКлимеразы I брешь заполни ери з о вывал и. Обработанными таким образом молекулами ДНК трансфицировали клетки 1. ДНК вирусного потомства анализировали на резистентность. Из выросших негативных колоний содержала вирусы, ДНК которых оказалась устойчива к действию рестриктазы. Другой вариант использования рестриктаз в качестве адреса предложен в работе . ДНК обрабатывали рестриктазой i рис. Трансфекция клеточного монослоя модифицированной

Рис. Отбор клонов, анализ вирусной ДНК на резистентность

II
. Рис. Схема направленного введения мутации с использованием I рестриктазы и мутагенного аналога цитозина оксицитидина . Трансфекция клеток . Окончательное превращение модифицированной ДНК, содержащей аналог основания, в мутантную осуществлялся i viv после трансфекции клеток. В потомстве отбирали ДНК, устойчивую к действию I рестриктазы. Цри модификации глобинового гена, находящегося в плазмиде рМВ9 наблюдалось до 2 таких мутантов. Оригинальный метод направленного введения мутаций с использованием рестриктазы, образующей двунитевой разрыв, предложен в работе ii . Авторы обрабатывали плазмиду, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий пролиновую тРНК,рестриктазой . Последняя разрывает двунитевую ДНК с образованием тупых концов i, , . Для получения однонитевых концевых участков ДНК авторы использовали 3 5 экзонуклеазную активность ДНКполимеразы К v фрагмент. Далее, также как и в работе i, , , ДНК обрабатывали бисульфитом натрия. Кольцевую форму ДНК восстанавливали в присутствии ДНКполимеразы и ДНКлигазы и трансформировали ею клетки. Описанные методы использования рестриктаз в качестве агентов, направляющих действие мутагена, имеют серьезное ограничение. Для их применения необходимо наличие рестрикционного сайта в том месте, где необходимо ввести мутацию. В работе i. Фрагмент гена, встроенного в плазмиду, вырезался рестриктазой и превращался в однонитевой с помощью экзонуклеазы III. В этих условиях гес а белок катализирует спаривание фрагмента с комплементарным участком ДНК плазмиды i . Последняя образует разрывы в неспаренных участках ДНК Томилин, V, . В результате образуется однонитевой разрыв, расположенный в пределах трехнитевого комплекса. Дальнейшая обработка бисульфитом с целью получения мутантов проводилась так же, как и в предыдущих работах. Данный метод локализации мутации является более универсальным . ДНК. Трехнитевые ДНКДНК комплексы использованы в работе , i, для получения делеций в тетрациклиновом локусе плазмиды рВН 2. С помощью рестриктаз из плазмиды выделялся локус, содержащий ген устойчивости к тетрациклину. Полученный рестрикт подвергался щелочной деградации до фрагментов со средней длиной 0 нуклеотидов. Далее, фрагменты отжигались с нативной ДНК плазмиды 2. Полученный субстрат обрабатывали 1 эндонуклеазой при 4С. Молекулы, содержащие трехнитевые ДНКДНК комплексы, переходили в линейную форму, а нативные кольцевые плазмидыв релаксированную. Линейные молекулы с помощью электрофореза отделяли от кольцевых, обрабатывали лигазой и трансформировали ими клетки . От до 1 трансформированных клеток были тетрациклинчувствительны. ДНК длиной 7 нуклеотидов.