Изучение структурных основ протеолитической активности пепсина на основе рентгеноструктурных исследований комплексов фермента с ингибиторами

• Автор: Гущина, Алла Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 148 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ МЕХАНИЗМА ПРОТЕОЛИГШЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТНЫХ ПРОТЕИНАЗ ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Аспартатные протеиназы. Основные характеристики различных представителей этого класса ферментов

1.1.1. Аминокислотный состав и сравнительный анализ первичных структур .

1.1.2. Сравнительная характеристика пространственных структур . . .

1.1.3. Некоторые представления об эволюционном развитии ферментов этого класса на основе сведений об их трехмерной структуре

1.2. Общие представления о строении активного центра аспартатных протеиназ

1.2.1. Специфические ингибиторы .

1.2.2. Каталитически активные остатки

1.3. Структурные особенности изменения протеолитической активности аспартатных протеиназ при различных химических модификациях функционально важных групп фермента
1.4. Специфичность аспартатных протеиназ .
1.5. Рентгеноструктурные подходы к выяснению механизма действия аспартатных протеиназ
1.5.1. Изучение ферментсубстратных взаимодействий на основе исследований комплексов с ингибиторами и модельных построений с гипотетическими субстратами
1.5.2. Конформационная подвижность некоторых сегментов молекул аспартатных протеиназ
Стр.
1.5.3. Некоторые представления о возможных механизмах действия аспартатных протеиназ
ГЛАВА И. ЭКСПЕРИМЕНТ АЖ1АЯ ЧАСТЬ.
2.1. Получение необходимого набора фаз для расчета разностных синтезов Фурье .
2.1.1. Поиски новых тяжелоатомных производных пепсина.
2.1.2. Получение трехмерного набора рентгеновских дифракционных данных для производного пепсина с соединением Р АН Сг
2.1.3. Определение координат тяжелых атомов для производного пепсина с соединением
Финальный синтез фурье пепсина, рассчитанный по фазам, полученным методом изоморфных замещений .
2.2. Получение рентгеновских экспериментальных данных для кристаллов комплексов пепсина с различными ингибиторами
2.2.1. Получение комплексов пепсина с соединениями парабромфеноцилбромидом, 1,2эпокси3параизофеноксипропаном ЭЕШП, метиловым эфиром дииодтирозилдииодтирозина ТирЗТирЗОМе, метиловым эфиром фенилаланилдииодтирозина
ФенТир0Ме . .
2.2.2. Сбор рентгеновских дифракционных данных для кристаллов комплексов пепсина с ингибиторами. Построение разностных синтезов Фурье.
Стр.
ГЛАВА III. АКТИВНЫЙ ЦЕНТР ПШСИНА И СРАВНЕНИЕ ЕГО С ДРУГИМИ
АКТИВНЫМИ ЦЕНТРАМИ АСПАРТАТНЫХ ПРОТЕИНАЗ .
3.1. Описание структуры активного центра пепсина
3.2. Сравнение структур активных центров пепсина
и аспартатных цротеиназ из ii ii и iii i.
3.3. Связывание этанола в активном центре пепсина
ГЛАВА 1У. РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
ПЕПСИНА С ИНГИБИТОРАМИ.
4.1. Интерпретация разностных синтезов электронной плотности, рассчитанных по фазам, полученным методом изоморфных замещений, для комплексов пепсина с ингибиторами
4.1.1. Комплексы пепсина с ЭПИП, пбромфеноцилбромидом, ТирТир0Ме
4.1.2. Комплексы пепсина с ФенТир0Ме .
4.2. Использование уточненных фаз для построения разностного синтеза электронной плотности ингибитора и уточнение модели ингибитора в мо
лекуле пепсина
ГЛАВА У. СТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ПЕПСИНА МАЛЫМИ МОЛЕКУЛАМИ И ИЗМЕНЕНИЯ ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДЛИНЫ СУБСТРАТА.
5.1. Ингибирующие свойства этанола .
5.2. Структурные особенности строения первичных мест связывания аспартатных цротеиназ, определяющие их каталитические свойства по отношению
к дипептидным субстратам.
5.3. Структурные аспекты изменения каталитических свойств пепсина в зависимости от длины субстрата
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


В последнее время появилось значительное число работ, посвященных изучению аспартатных протеиназ, выделяемых из низших грибов. РНоптимум каталитической активности этих протеиназ наблюдается в области . Все они ингибируются специфическими ингибиторами этого класса диазокарбонильными соединениями, эпоксидами и природными ингибиторами типа пепстатина пептида, выделяемого из II. Аминокислотный состав и сравнительный анализ первичных структур. Все эти ферменты характеризует почти одинаково высокое содержание остатков дикарбоновых аминокислот, в то время как содержание основных аминокислотных остатков является относительно низким. Наиболее низким оно является для пепсина А, содержащего 4 основных аминокислотных остатка. В зимогенах содержание основных остатков аминокислот более высокое. Эта особенность является общей структурной чертой зимогенов аспартатных протеиназ животного происхождения. Неактивные предшественники аспартатных протеиназ из низших организмов пока не найдены. Количество гидрофобных аминокислотных остатков варьируется
от до от общего числа аминокислотных остатков в разных ферментах. В настоящее время установлена полная первичная структура для пепсина свиньи , аспартатной протеиназы из РетаИит атеРит и химозина теленка , а также аспартатной протеиназы из 0. Ми аыатой . На международном совещании года по структуре и функции аспартатных протеиназ были представлены материалы по сопоставлению первичных структур ренина, человеческого, свиного и куриного пепсиногенов, прохимозина и двух грибных протеиназ пенициллопепсина и протеиназы из Шисог т1еке1 . Фрагменты аминокислотной последовательности определены для некоторых аспартатных протеиназ из грибов и животных . Молекулы ферментов состоят из одной полипептидной цепи с тремя внутримолекулярными дисульфидными мостами в пепсине, химозине, гастриксине, и с двумя дисульфидными мостами в ризопуспепсине и одним в пенициллопепсине. Первичные структуры аспартатных протеиназ из высших и низших организмов довольно сильно различаются между соОой количество гомологичных остатков в пепсине и пенициллопепсине составляет . Однако можно выделить отдельные гомологичные участки структур. Высокогомологичными участками во всех аспартатных протеиназах являются участки вокруг остатков активных аспарагиновых кислот и на сегментах . Изучение аспартатных протеиназ методами дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма показало, что грибные протеина
зы , пепсин ,, химозин , в основном, являются 3 белками. Единственным методом, позволяющим определить точное расположение атомов в структуре белка, является метод рентгеноструктурного анализа. А . С,углеродных атомов топологически
эквивалентны среднеквадратичное отклонение 1, А . А . На рис. I представлена стереопара хода полипептидной цепи в молекуле пепсина. Рис. I. Стереоизображение хода полипептидной цепи в молекуле пепсина. Как уже было сказано, молекула фермента имеет двухдоменную структуру. Первый домен, называемый концевым доменом, образуют остатки с I по 3 Суглеродных атомов, а также Сконцевая петля с остатками . Остальная пасть полипептидной цепи формирует Сконцевой домен молекулы. Исследование структур грибных протеиназ показало, что два домена связаны псевдодвойной осью симметрии . I А. Однако структура молекулы оказалась еще более высоко сишетричной. Удивительная особенность строения молекулы была обнаружена Андреевой Н. С. в пепсине . Оказалось, что оба домена состоят из четырех повторяющихся по ходу полипептидной цепи пепсина одинаковых структурных единиц. На рис. Как видно из рисунка существует некая структурная единица, четырехкратное повторение которой и образует третичную структуру фермента. Длина одной структурной единицы составляет приблизительно аминокислотных остатков. Р шпилька,обозначаемая Аэлемен
второй широкая петля, или Вэлемент, третьим элементом является спираль С, и четвертым вновь Р шпилька, или элемент. В терминах структурных единиц и образующих их элементов довольно легко и наглядно описать трехмерную структуру фермента, определить в ней положение любого аминокислотного остатка.