Количественный анализ результатов флуориметрического исследования хромосом человека в потоке и оптимизация условий их сортировки

• Автор: Кузнецова, Анна Вадимовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Цитометрия в потоке общие сведения.

2.1.1. Анализ клеток и хромосом в потоке.

2.1.2.Принцип сортировки объектов в потоке

2.2.Объект исследований хромосомы

2.2.1.Выделение хромосом

2.2.2.0крашивание хромосом

2.3.Флуориметрический анализ и сортировка хромосом в потоке

2.3.1 .Однопараметрический и двухпараметрический анализ.
2.3.2.Сортировка хромосом.
2.4. Количественный анализ проточных кариотипов
2.4.1.Количественное описание проточных кариотипов
2.4.2.Вычислительные методы анализа проточных кариотипов
2.4.3.Задачи и проблемы количественного анализа проточных
кариотипов.
3. МЕТОДЫ
3.1 .Процедура разложения распределений на компоненты,
соответствующие отдельным хромосомам
3.1.1 .Предварительная обработка данных.
3.1.2. Удаление загрязняющих сигналов.
3.1.3.Разложение экспериментальных распределений на составляющие компоненты
3.2. Процедура определения чистоты и эффективности сортировки
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1.Этапы количественного анализа проточных кариотипов человека
4.1.1. Аппроксимация примесных сигналов.
4.1.2.Выделение хромосомных компонент в однопараметрических распределениях
4.1.3.0 цен ка точности разложения и эксперимента в целом.
4.2.Анализ однопараметрических распределений.
4.2.1.Серийный анализ последовательных однотипных экспериментов
4.2.2.Анализ результатов, полученных с использованием различных красителей
4.2.3.Анализ кариотипов, имеющих аберрации
4.3.Анализ экспериментальных двупараметрических распределений
4.3.1.Анализ двупараметрического распределения хромосом человека, выделенных из клеточной линии
4.3.2.Количественный анализ данных по фракционированию в градиенте плотности сахарозы
4.4.Оптимизация условий выделения хромосом при их сортировке в потоке .
4.4.1.Факторы, влияющие на чистоту и эффективность сортировки при однопараметрических исследованиях хромосом в потоке.
4.4.2.Применение процедуры расчета параметров чистоты и эффективности сортировки к однопараметрическим экспериментальным данным
5. ВЫВОДЫ
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение А. Таблицы разложения распределений, использованные в
Приложение В. Характеристики процедур анализа распределений.
Приложение С. Выделение хромосом и флуориметрический анализ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Дополнительными факторами, лимитирующими разрешение, являются чувствительность фотоумножителя, шумовой уровень фотоумножителя и используемых аналоговых электронных элементов в основном первых усилительных каскадов, а также ошибки при аналогоцифровом преобразовании Полетаев, . Вовторых, однородностью освещения объектов в зоне анализа , . При относительно небольших скоростях анализа все микрообъекты пересекают зону анализа точно вдоль оси потока, которая по положению совмещена с оптическими осями возбуждающего пучка света и регистрирующей системы. В большинстве цитометров однородность достигается тем, что центральная часть струи с объекгами анализа диаметр, не превышающий нескольких микрон 35 мкм. При повышении скорости анализа происходит увеличение диаметра потока с образцом и как следствие отклонение значительной части объектов от оси потока и, следовательно, от оптической оси системы, что приводит к вариации их освещенности их в зоне анализа. Этот неблагоприятный фактор минимизируется путем использования специальной конфигурации возбуждающих пучков и лазеров большой мощности, способных вызывать насыщающее возбуждение всех молекул красителя на хромосомах , . В современных стандартных приборах типичными условиями достаточно скоростного анализа при сохранении высокого разрешения являются следующие скорость анализа объектов в секунду, концентрация образца 7мл, скорость потока мс, диаметр потока, несущего микрообъекты 35 микрон Полетаев, . Области применения проточной цитометрии разнообразны сначала интенсивно развивался количественный анализ внутриклеточных компонентов, таких содержание ДНК, РНК и тотальных белков на основе традиционных хроматических цитохимических реакций, позднее флуоресцентные цитохимические методы стали практически единственными реально применяющимися Полетаев, , . Сейчас в молекулярной и клеточной биологии широко используется флуориметрический анализ для определения содержания ДНК в клетке при анализе клеточного цикла, исследования цитоплазмы с помощью 2, Са2, чувствительных флуориметрических зондов, количественного анализа различных поверхностных и внутриклеточных антигенов, анализа хромосомного набора различных растительных и животных клеток, анализа активности митохондрий, измерения потенциала клеток, уровня активных форм кислорода и др. Полетаев, , i, , v , . Сортировка объектов в стандартных проточных цитометрахсортировщиках осуществляется следующим образом. Непосредственно после прохождения проточной ячейки формируется струя диаметром 34мкм. Ультразвуковой вибратор вызывает продольные колебания сформированной струи с частотой кГц, в результате чего на некотором расстоянии от зоны анализа струя разбивается на отдельные капли. При реальных скоростях анализа обсек один объект приходится на 3 капель. Если анализатор прибора зарегистрировал прохождение объекта с характеристиками в пределах, установленных для сортировки, то выдается электронный сигнал на выделение этого объекта. С некоторой задержкой во времени равной времени движения объекта ог зоны анализа до точки разделения струи на капли на струю подается электрический импульс, в результате чего группе капель обычно 3 капли, одна из которых содержит нужный объект, сообщается электрический заряд либо положительного, либо отрицательного знака. Оторвавшись от струи, заряженные капли пролетают между плоскими пластинами, обеспечивающими высокую напряженность электрического поля 1. Всм в пространстве между ними, и отклоняются в сторону одного из электродов в соответствии со знаком своего заряда. Поскольку сообщаемый капле заряд может быть двух знаков, то в стандаргных приборах возможно выделять две фракции объектов параллельно. Фракции микрочастиц собираются в тсрмостатирусмыс пробирки или на специальные фильтры, после чего они пригодны к дальнейшим исследованиям. Параметры объектов, выделяемых во фракции, задаются через ЭВМ на основе анализа результатов исследования в потоке.